本篇继续使用上一章的公开 airway 计数数据及保存的 airway_bundle.rds，只演示 bulk RNA-seq 的样本检查与功能分析。它不是单细胞教程，也不提供针对个人的医疗解释。下面代码是供读者运行的学习脚本，本机没有执行，因此文中没有虚构的 PCA 分离效果、富集通路名单或显著性数值。

1. QC 应在检验前做，结果出来后还要复核

这篇把画图安排在统计学习练习之后，是为了复用上一章保存的对象，不意味着正式项目应先差异检验、后审查样本。实际工作应先确认原始读段和计数层面的质量，发现身份存疑、失败文库或明显异常时暂停；建模后再用诊断检查模型和候选是否出现新的问题。

我习惯给异常记录分三格：观察到什么、有哪些可能原因、准备怎样验证。比如某个样本的分配到基因的计数总量偏低，可能与测序深度、rRNA、比对、参考或建库有关，不能直接写成“这个样本生物学上表达更低”。先看第一篇的处理报告，再核对原始实验记录，远比直接删样本更有解释力。

MultiQC 可以连接上游多个工具的线索；计数层面的样本图则检查输入矩阵与元数据之间是否一致。这两类 QC 互相补充，不互相替代。尤其要注意 colSums(counts(dds)) 是进入当前矩阵的基因计数和，不是原始 FASTQ 的总 reads，也不是必然等于比对 fragments。nf-core/rnaseq 3.27.0 输出定义、MultiQC 官方概览

2. 探索图回答的是结构，不自动回答显著性

直接对原始计数做欧氏距离，高表达基因和深度差异可能主导图。用于探索时通常采用方差稳定化等变换，便于观察样本间结构；差异检验仍使用计数模型，并不把转换值再塞回原始计数入口。VST 与样本距离、PCA 的关系可参照 Bioconductor 官方 RNA-seq 工作流。

PCA 上处理组分开，是整体表达结构的一种观察，不是每个基因都差异表达的证明；处理组没有分开，也不自动否定局部效应。应同时按来源、批次、时间等真实信息标记，辨认最大的变异来自哪里。blind = FALSE 使用已有设计进行变换，也不会把来源或批次从矩阵里凭空删除。

热图也需要声明选基因的方法。先用显著基因筛选，再展示两组明显分开，不能把这种图当成独立证明。本练习选高变异基因作探索并进行行中心化：颜色表示某基因在各样本相对其平均值的变化，不表示不同基因间的绝对表达量高低。

3. 完整学习脚本第一段：读取 bundle 并保存图

需要已经具备上一章的 R/Bioconductor 依赖；后半段还需要 clusterProfiler、AnnotationDbi 和 org.Hs.eg.db。代码只检查依赖，不自动安装。org.Hs.eg.db 适用于这个人类数据例子，不能不改物种就用于小鼠、植物或微生物。准备依赖的正规入口仍是 Bioconductor 安装说明。

将本节与下一节的两个 R 代码块按顺序放入同一个 airway_qc_enrichment_learning.R 文件。运行方式为 Rscript airway_qc_enrichment_learning.R "上一章生成的完整路径/airway_bundle.rds"。输出创建在当前学习工作目录下一个带唯一名称的新目录，Rscript 退出后仍保留，不覆盖上一章文件。

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needed <- c("DESeq2", "SummarizedExperiment", "clusterProfiler",
            "AnnotationDbi", "org.Hs.eg.db")
available <- vapply(needed, requireNamespace, logical(1), quietly = TRUE)
if (!all(available)) stop("Prepare packages first: ",
                         paste(needed[!available], collapse = ", "))
suppressPackageStartupMessages({
  library(DESeq2)
  library(SummarizedExperiment)
  library(clusterProfiler)
  library(org.Hs.eg.db)
})
args <- commandArgs(trailingOnly = TRUE)
if (length(args) != 1L || !file.exists(args[1])) {
  stop("Usage: Rscript airway_qc_enrichment_learning.R AIRWAY_BUNDLE_PATH")
}
bundle <- readRDS(args[1])
stopifnot(identical(bundle$input, "Public airway teaching dataset"))
dds <- bundle$dds
res <- bundle$res
stopifnot(inherits(dds, "DESeqDataSet"), inherits(res, "DESeqResults"),
          identical(rownames(dds), rownames(res)),
          identical(colnames(dds), rownames(colData(dds))))
out <- tempfile("perry-airway-qc-", tmpdir = getwd())
stopifnot(dir.create(out))

qc <- data.frame(
  sample_id = colnames(dds),
  condition = colData(dds)$condition,
  subject = colData(dds)$subject,
  modeled_gene_count_sum = colSums(counts(dds)),
  modeled_genes_with_nonzero_count = colSums(counts(dds) > 0),
  size_factor = sizeFactors(dds)
)
write.table(qc, file.path(out, "sample_count_qc.tsv"),
             sep = "\t", row.names = FALSE, quote = FALSE)

vsd <- varianceStabilizingTransformation(dds, blind = FALSE)
png(file.path(out, "pca.png"), width = 1200, height = 850, res = 120)
print(plotPCA(vsd, intgroup = c("condition", "subject")))
dev.off()
vmat <- assay(vsd)
distances <- as.matrix(dist(t(vmat)))
png(file.path(out, "sample_distance.png"), width = 1100, height = 1100)
heatmap(distances, symm = TRUE, scale = "none",
         main = "Airway teaching data: sample distance")
dev.off()

variances <- apply(vmat, 1, var)
top <- head(order(variances, decreasing = TRUE), 30L)
centered <- sweep(vmat[top, , drop = FALSE], 1,
                  rowMeans(vmat[top, , drop = FALSE]), "-")
png(file.path(out, "high_variance_genes.png"), width = 1200, height = 1200)
heatmap(centered, scale = "none", Colv = NA,
         main = "High-variance genes: row-centered VST")
dev.off()
capture.output(sessionInfo(), file = file.path(out, "sessionInfo.txt"))

读图时先检查轴、颜色和样本顺序，再看聚类。样本距离图中的“近”，依赖所用的变换、特征与距离定义；不能把它直接解释成两位供者在其他生物学层面更相似。若一个样本的位置意外，先查身份、处理、文库与参考记录，再形成排除决定，并评估排除是否破坏配对或造成混杂。

4. ORA 的背景是选择机会，不是随便找的一张基因表

过度代表分析（ORA）问的是：相对于一个明确背景，候选列表里某类注释是否更常见？背景应代表此次分析中有机会成为候选、且能进入相应注释检验的基因，不应自动等于全基因组，也不能只取显著基因。否则你改变了“原本有多少机会选中这类基因”的基准，结论可能被这种选择改变。Gene Ontology 官方富集说明

本例明确规定：候选规则基于本次普通检验的有限 padj；背景取拥有有限 pvalue 和 padj、同时具有 BP 注释的全部基因，包含不显著基因。被预过滤排除或因异常而未检验的基因不进入背景；独立过滤后没有 padj 的基因在本例也不属于这次 FDR 候选选择空间。正式分析可以有不同的合格基因定义，但必须说明规则，并同步应用到背景和前景，不能在得到通路结果后随意扩大背景。

这里分别考虑正、负效应的候选，而不是把两个方向都塞进一个列表后宣称通路“上调”。为了让示例可检查，代码只运行正效应列表；读者可以按同一背景构造负效应列表另做分析，并明确那是另一个候选集合。Gene Ontology 注释也有版本与覆盖限制，必须记录注释库日期、未映射基因与纳入数量。

5. 完整学习脚本第二段：明确背景的 GO 与完整排序的 GSEA

下面沿用同一个 R 文件中的 dds、res 与 out。选择 ENSEMBL 作为 keyType，避免为了演示而将所有 ID 转成容易发生多对一的符号。正式数据若带版本号，应先核对来源，做有记录的转换并检查转换后的重复，不能盲目删后缀。

enrichGO 不传 universe 时会使用数据库背景，因此这里显式传入经过检查的背景。函数参数与输出约定见 作者维护的 enrichGO 文档。

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ids <- rownames(res)
stopifnot(!anyDuplicated(ids), all(grepl("^ENSG[0-9]+$", ids)))
orgdb <- org.Hs.eg.db
stopifnot("ENSEMBL" %in% AnnotationDbi::keytypes(orgdb))
known <- intersect(ids, AnnotationDbi::keys(orgdb, keytype = "ENSEMBL"))
stopifnot(length(known) > 0L)
annotation <- AnnotationDbi::select(
  orgdb, keys = known, keytype = "ENSEMBL",
  columns = c("GOALL", "ONTOLOGYALL")
)
bp_rows <- !is.na(annotation$GOALL) & !is.na(annotation$ONTOLOGYALL) &
           annotation$ONTOLOGYALL == "BP"
bp_ids <- unique(annotation$ENSEMBL[bp_rows])
fdr_eligible <- is.finite(res$pvalue) & is.finite(res$padj)
universe <- intersect(ids[fdr_eligible], bp_ids)
candidate_up <- is.finite(res$padj) & res$padj < 0.05 &
                is.finite(res$log2FoldChange) & res$log2FoldChange > 0
foreground <- intersect(ids[candidate_up], universe)
stopifnot(length(universe) > 0L, all(foreground %in% universe))
writeLines(universe, file.path(out, "ora_background_ensembl.txt"))
writeLines(foreground, file.path(out, "ora_positive_foreground_ensembl.txt"))
writeLines(setdiff(ids, known), file.path(out, "not_in_annotation_keyspace.txt"))
capture.output(orgdb, file = file.path(out, "annotation_database_info.txt"))
audit <- data.frame(
  definition = c("modeled_genes", "finite_p_and_padj", "BP_ORA_background",
                 "positive_FDR_candidates_in_background"),
  n = c(length(ids), sum(fdr_eligible), length(universe), length(foreground))
)
write.table(audit, file.path(out, "enrichment_input_audit.tsv"),
             sep = "\t", quote = FALSE, row.names = FALSE)

if (length(foreground) > 0L) {
  ora <- enrichGO(gene = foreground, universe = universe, OrgDb = orgdb,
                   keyType = "ENSEMBL", ont = "BP", pAdjustMethod = "BH",
                   pvalueCutoff = 1, qvalueCutoff = 1,
                   minGSSize = 10, maxGSSize = 500, readable = FALSE)
  ora_table <- as.data.frame(ora)
  write.table(ora_table, file.path(out, "ora_positive_BP_returned_terms.tsv"),
               sep = "\t", quote = FALSE, row.names = FALSE)
} else {
  message("No foreground genes: ORA skipped, not an enrichment result")
}

# A separate eligibility rule for preranked GSEA, not the ORA foreground.
# Keep finite test statistics even if independent filtering made padj NA.
rank_ok <- is.finite(res$stat) & is.finite(res$pvalue) & ids %in% bp_ids
ranking <- setNames(res$stat[rank_ok], ids[rank_ok])
ranking <- sort(ranking, decreasing = TRUE)
stopifnot(length(ranking) >= 10L, !anyDuplicated(names(ranking)))
write.table(data.frame(gene_id = names(ranking), Wald_stat = unname(ranking)),
             file.path(out, "gsea_ranked_genes.tsv"),
             sep = "\t", quote = FALSE, row.names = FALSE)
# Use gseGO's fixed default seed; preserve the actual package version.
gsea <- gseGO(geneList = ranking, OrgDb = orgdb, keyType = "ENSEMBL",
               ont = "BP", minGSSize = 10, maxGSSize = 500,
               pvalueCutoff = 1, pAdjustMethod = "BH",
               verbose = FALSE, seed = TRUE)
write.table(as.data.frame(gsea), file.path(out, "gsea_BP_returned_terms.tsv"),
             sep = "\t", quote = FALSE, row.names = FALSE)
saveRDS(list(background = universe, foreground = foreground,
             ranking = ranking, gsea = gsea,
             gsea_seed_setting = TRUE,
             contrast = bundle$contrast, dataset = bundle$input),
         file.path(out, "enrichment_bundle.rds"))
message("Teaching QC/enrichment outputs: ", normalizePath(out))

pvalueCutoff = 1 与 qvalueCutoff = 1 是为了减少结果展示前的阈值截断，方便学习查看函数返回的表，并不把返回的所有行都标成显著；函数仍可能因注释、集合大小或不可用统计量不返回某些条目。报告候选富集时要另行声明校正后的阈值和所检查的条目范围。空表也是可能结果，不能编造一个通路名让练习显得成功。

代码使用该人类数据例子可识别的基因 ID；它的检查刻意严格，不是可直接接收任意物种矩阵的万能脚本。AnnotationDbi::select 返回一对多注释是正常现象，因为一个基因可以属于多个 GO 条目；不应把这些注释行误当成多个独立基因。注释查询接口与映射关系可参考 AnnotationDbi 官方说明。

6. GSEA 不只使用显著基因，也不靠随机抖动修饰排名

ORA 需要先定义候选集合；预排序 GSEA 则使用具有可用统计量的完整合格排序列表，不先截成显著基因。本例采用带方向的 Wald 统计量，越靠顶部越支持 treated 相对 control 的正方向，底部支持负方向。不能用绝对值排名后还把 NES 解释成处理上调/下调；也不要用不带符号的 p 值排名期待保留方向。GSEA 官方排序与方向说明

排序中要有唯一基因 ID、有限数值和明确方向；注释与排序 keyType 要一致。遇到很多并列排名，先检查数据分辨率、过滤和排序统计量，并保留软件警告，不要为了没有警告而随意添加随机噪声。基因集合版本、集合大小范围和随机设置都应记录；不同版本返回不同结果时，有这些记录才可以调查。作者维护的 gseGO 参数文档

还要区分预排序方法和基于样本标签置换的标准 GSEA，它们使用的信息和假设不同；不能认为本例会自动解决小样本、配对或基因相关性带来的所有问题。复杂研究需要根据设计选择适合的基因集方法，富集分析本身也不能补救不可信的差异表达输入。

7. 富集不是“通路已激活”，显著不是“机制已证明”

假设一个候选列表富集到与免疫相关的条目，谨慎的表述是：在这个候选定义、背景和注释版本下，这类基因出现得比背景预期更集中。它没有自动证明免疫功能增强，也没有说明改变发生在哪种细胞。bulk 样本的变化可能来自细胞组成、细胞状态或二者同时改变，单靠这一张表不能区分。

同样，GSEA 的正 NES 表示某个集合倾向排序顶部，不等于所有成员都增加，更不等于生化通路的净活性增强。应查看贡献基因、它们的方向与效应、集合里的抑制/促进关系和实验背景，再决定可以提出什么后续假设。选择一个预期相关的条目作图，也不能隐藏同时检验的其他条目。

GO 的多个条目可能共享很多基因。几十个相关名称不一定是几十个独立发现，图上的气泡数量更不是机制数量。解释时可以按主题整理冗余条目，但保存原始表、规则和贡献基因，避免整理过程只留下最符合故事的词。对机制结论，还需要独立干预、时间顺序、蛋白或功能层面的证据，而不是继续给同一批差异基因换一个富集工具。

8. 把结果写成可检查的四句话

第一句说明样本、实验单位与对比方向。第二句说明预处理、过滤、设计公式、QC 和任何排除。第三句报告效应与不确定性，并说明 FDR、候选规则、ORA 背景或 GSEA 排序方法。第四句区分已观察到的结构、统计支持的关联和仍需验证的机制解释。

例如可以先写“本练习使用公开 airway 数据，比较 treated 相对 control，并在设计中考虑来源配对”，再根据实际运行的结果填入检查与数字。不要把“运行完成”“文件存在”写成“结果正确”，也不要从代码模板自动生成尚未观察到的生物学结论。

9. 三个值得自己动手的自检

先数一数 ORA 背景与前景的大小，并检查前景确实是背景子集。然后只在教学副本中把背景错误地改为前景，观察为什么这改变了问题；不要将错误实验作为正式分析。最后把 GSEA 排序方向反过来，查同一个条目的方向如何随对比改变，并写出其含义，而不是只看显著性是否保留。

也可以把上一章 padj 为 NA 的行按原因归类，比较它们是否有 p 值和统计量。理解这些行为什么不被同一规则纳入 ORA，却可能仍在合格 GSEA 排名中，比机械删掉所有 NA 更有帮助。

至此，一个完整的入门交付包包括：原始输入与元数据、处理和参考版本、QC 与模型记录、全量差异表、明确的候选/背景/排名文件、注释版本、图与解释边界。能重新生成它们、能说明每个选择，比只拥有一张漂亮的火山图更接近可信分析。

上一章：DESeq2 设计公式与对比；课程起点：实验设计、FASTQ 与计数。

参考与继续阅读

• Bioconductor：官方 RNA-seq 探索与差异表达工作流
• Gene Ontology：富集、背景与结果解释
• clusterProfiler：官方包说明
• clusterProfiler 作者文档：enrichGO
• clusterProfiler 作者文档：gseGO
• AnnotationDbi：注释与 ID 查询
• GSEA 官方用户指南

本文只讨论 bulk RNA-seq，不是单细胞分析。本篇练习使用 Bioconductor airway 包附带的公开计数对象，不需要先下载原始 FASTQ。它包含四个气道平滑肌细胞来源的处理与未处理样本，适合演示配对关系。数据背景来自 airway 官方说明。这里学习统计流程，不将演示结果当成新的实验发现或医疗建议。

代码按 2026-10-06 核验的官方 API 组织，DESeq2 官方教程标注的包版本为 1.52.0。读者实际运行要记录自己的版本，不能只写“用了 DESeq2”。本机未执行下列 R 分析，因此本文不提供杜撰的差异基因数量、p 值或结果图片。

1. 先确认输入，而不是先调用 DESeq

最容易让整个分析失去意义的错误，是把样本标签与计数列错配。一个矩阵有六列，元数据也有六行，这只是尺寸相同，不是身份相同。必须先检查 ID 唯一、双方集合相同，再按 ID 重排，最后检查顺序完全一致。

第二个检查是输入单位。普通的计数矩阵入口要求非负、有限、整数的原始计数，不接受 TPM、FPKM、VST、rlog 或已经做过库大小缩放的数值。发现小数时应追问生成方法，不能为了通过构造函数而直接四舍五入。Salmon 估计计数的小数可以走 tximport 的专门入口，和 TPM 伪装计数不是同一回事。DESeq2 计数输入说明

第三个检查是元数据与实验设计。没有足够独立生物学重复、关键标签存疑或明显失败文库时，应暂停检验。已经知道的配对关系不能因为“不加这个变量也能跑”就忽略；batch 也不能因为 PCA 看起来有影响就随意追加，而应先追查真实实验记录以及它是否可与处理因素分别估计。

2. 设计公式是一张解释承诺，不是装饰

考虑三个原创的假设问题：独立来源的处理/对照比较可写 ~ condition；两组都分布在各批次且批次效应可估计时可写 ~ batch + condition；同一个来源各自提供处理与对照样本时可写 ~ subject + condition。这些公式回答的问题不一样，不能只以哪张火山图更漂亮为选择标准。

本篇的 airway 练习采用 ~ subject + condition，将来源之间的稳定差别和我们感兴趣的处理差别区分开。这个加性模型估计一个共同的处理系数，不估计来源与处理的交互；它不能证明各来源的真实效应相同，也不能涵盖所有重复测量问题。复杂时间序列、多层随机效应或处理交互需要另外设计模型；不要把两个条件的配对模板复制到所有实验上。DESeq2 官方配对与多因素分析入口

若所有对照都来自 B1、所有处理都来自 B2，那么 batch 与 condition 携带同一份分组信息。~ batch + condition 无法告诉我们变化究竟来自处理还是批次，这不是把 batch 变量删掉就解决了。设计矩阵的满秩检查可以发现不可分别估计的参数，但“满秩”也不保证混杂完全消失或样本量足够，只是必要的数学检查。

3. 完整练习：公开计数、配对模型与结果保存

运行前需要可用的 R 与相容的 Bioconductor 环境，并已经具备 airway、SummarizedExperiment、DESeq2、apeglm。本段检查依赖是否存在，不会自动安装。依赖缺失时先根据 Bioconductor 官方安装说明准备独立环境，确认安装权限、联网条件与版本兼容，再运行练习。

将下面代码保存为 airway_deseq2_learning.R，在自己的学习工作目录运行 Rscript airway_deseq2_learning.R。它只读取包自带的公开数据，在当前工作目录下创建一个带唯一名称的全新结果目录，不覆盖已有目录，也不会因 Rscript 退出而随会话临时目录消失。

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required <- c("airway", "SummarizedExperiment", "DESeq2", "apeglm")
available <- vapply(required, requireNamespace, logical(1), quietly = TRUE)
if (!all(available)) {
  stop("Prepare compatible R/Bioconductor packages first: ",
       paste(required[!available], collapse = ", "))
}
suppressPackageStartupMessages({
  library(airway)
  library(SummarizedExperiment)
  library(DESeq2)
})
data("airway", package = "airway")
cts <- assay(airway, "counts")
meta <- as.data.frame(colData(airway))

stopifnot(is.matrix(cts), is.numeric(cts), all(is.finite(cts)),
          all(cts >= 0), all(cts == floor(cts)),
          all(cts <= .Machine$integer.max),
          !anyDuplicated(rownames(cts)), !anyDuplicated(colnames(cts)),
          !anyDuplicated(rownames(meta)),
          setequal(colnames(cts), rownames(meta)))
meta <- meta[colnames(cts), , drop = FALSE]
stopifnot(identical(colnames(cts), rownames(meta)))
meta$subject <- factor(meta$cell)
meta$condition <- factor(meta$dex,
                         levels = c("untrt", "trt"),
                         labels = c("control", "treated"))
stopifnot(!anyNA(meta$subject), !anyNA(meta$condition),
          nlevels(meta$subject) >= 3L,
          all(table(meta$subject, meta$condition) == 1L))

design_formula <- ~ subject + condition
design_matrix <- model.matrix(design_formula, data = meta)
if (qr(design_matrix)$rank != ncol(design_matrix)) {
  stop("Design is not full rank: review confounding and unused levels")
}
if (nrow(design_matrix) <= ncol(design_matrix)) {
  stop("No residual degrees of freedom for this teaching model")
}
storage.mode(cts) <- "integer"
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = cts, colData = meta,
                             design = design_formula)

# A declared, condition-independent teaching prefilter.
smallest_group <- min(table(meta$condition))
keep <- rowSums(counts(dds) >= 10L) >= smallest_group
stopifnot(any(keep))
dds <- dds[keep, ]
dds <- DESeq(dds)
res <- results(dds, contrast = c("condition", "treated", "control"),
               alpha = 0.05)
coef_name <- "condition_treated_vs_control"
stopifnot(coef_name %in% resultsNames(dds))
res_shrunk <- lfcShrink(dds, coef = coef_name, type = "apeglm")

tab <- data.frame(gene_id = rownames(res), as.data.frame(res),
                  row.names = NULL, check.names = FALSE)
tab$log2FC_shrunk <- res_shrunk$log2FoldChange[
  match(tab$gene_id, rownames(res_shrunk))
]
tab$has_test_pvalue <- is.finite(tab$pvalue)
tab$has_adjusted_pvalue <- is.finite(tab$padj)

out <- tempfile("perry-airway-de-", tmpdir = getwd())
stopifnot(dir.create(out))
saveRDS(cts, file.path(out, "input_raw_counts.rds"))
write.table(meta, file.path(out, "sample_metadata.tsv"),
             sep = "\t", quote = FALSE, col.names = NA)
write.table(tab[order(tab$padj, na.last = TRUE), ],
             file.path(out, "treated_vs_control.tsv"),
             sep = "\t", row.names = FALSE, quote = FALSE)
saveRDS(list(dds = dds, res = res, res_shrunk = res_shrunk,
             metadata = meta, design = design_formula,
             contrast = c("condition", "treated", "control"),
             input = "Public airway teaching dataset"),
         file.path(out, "airway_bundle.rds"))
capture.output(sessionInfo(), file = file.path(out, "sessionInfo.txt"))
capture.output(resultsNames(dds), file = file.path(out, "coefficients.txt"))
message("Teaching outputs saved to: ", normalizePath(out))
message("Keep the printed bundle directory path for lesson 3.")

这里的预过滤规则是在最小条件组样本数那么多的样本中，计数至少为 10。它是为了教学声明的一种规则，不是所有物种、测序深度和实验的唯一正确选择，也不是先看对比结果再把不喜欢的基因删掉。保存的原始计数没有因过滤而消失，结果表则对应进入模型的基因。

运行结束后，结果目录保留在你启动 Rscript 时的当前学习工作目录里。保存打印出的完整目录路径，其中的 airway_bundle.rds 将作为下一篇的输入；不要移动或重命名后还使用旧路径。这里 tempfile() 只是生成一个未被占用的目录名称，实际位置明确指定为 getwd()，并非 R 会话自动清理的临时目录。

4. 如何读一行结果：效应与证据要分开

baseMean 描述归一化计数的平均水平；log2FoldChange 是该对比的效应估计；lfcSE 表达其标准误；stat、pvalue 和 padj 是相应统计检验与多重比较处理的产物。这里的方向固定为 treated 相对 control，正值表示模型下处理组更高，负值表示更低。将分子分母互换，效应符号随之改变，所以导出的表必须附有对比说明。DESeq2 结果字段手册

如果一个基因估计 log2FC 为 1，表示该模型中的相对倍数约为 2；这只是算术含义，不意味着这个基因一定显著，更不意味着它是整个表里最重要的基因。另一个基因可以有很小的效应，却因为信息更充分而得到较小 p 值。解释时应同时看效应、精度、表达水平和研究问题，而不是把单个数字当作综合评分。

padj < 0.05 是在特定模型、数据和假设下控制多重检验错误的一种判定规则，不是“这个基因有 95% 的概率是真的”，也不是任意一个选中基因有恰好 5% 假阳性概率。阈值之外的基因也不自动等于无变化。BH 等多重比较方法的定义可参阅 R 官方 p.adjust 文档。

5. shrink、筛选与效应阈值检验不是同一件事

当一个基因信息少或变异较大时，未经收缩的倍数估计可能很极端。lfcShrink 提供更稳定的效应估计，常用于可视化和效应排序。这不等于重新定义了本篇普通 Wald 检验的原假设，也不是把所有小效应变成“没有生物学意义”。本练习明确保留原检验的 pvalue/padj，另列 log2FC_shrunk，避免读者不知道某一列来自哪一步。收缩的模型依据可阅读 DESeq2 原始方法论文。

“普通检验 padj 小于阈值，并且收缩后绝对 log2FC 大于 1”可以作为声明过的候选展示规则，却不等价于已经检验“真实绝对效应大于 1”。若问题确实是超过一个预先指定的最小效应，应使用相应的效应阈值检验，例如：

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# 在完整练习后继续运行：检验 |log2FC| 是否超过预定阈值1。
# 它产生新的检验结果，不能混称为上面的普通差异检验。
res_min_effect <- results(
  dds,
  contrast = c("condition", "treated", "control"),
  lfcThreshold = 1,
  altHypothesis = "greaterAbs",
  alpha = 0.05
)

默认 DESeq() 足够用于这个常规 bulk 学习入口。不要看到某篇单细胞性能教程，就盲目切换到 glmGamPoi 或同时改多项参数。任何拟合方式、离群值处理和阈值变更，都应说明对应的数据特征与验证依据，而不只是追求运行更快或基因更多。

6. Salmon 输入的替代入口：不把 TPM 当成计数

如果上一篇实际采用 Salmon 定量，建议从每样本 quant.sf 导入，而不是手动抽出 TPM 交给 DESeqDataSetFromMatrix()。下面是有真实文件之后的替代入口模板，不需要和 airway 练习同时运行。

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# metadata.tsv: first column sample_id; other columns include condition.
# tx2gene.tsv: two named columns, transcript_id and gene_id, from the same reference.
library(tximport)
library(DESeq2)
meta <- read.delim("metadata.tsv", row.names = 1, check.names = FALSE)
stopifnot(!anyDuplicated(rownames(meta)))
meta$condition <- factor(meta$condition, levels = c("control", "treated"))
stopifnot(!anyNA(meta$condition))
files <- setNames(file.path("salmon", rownames(meta), "quant.sf"), rownames(meta))
stopifnot(all(file.exists(files)))
tx2gene <- read.delim("tx2gene.tsv", check.names = FALSE)
stopifnot(identical(names(tx2gene), c("transcript_id", "gene_id")),
          !anyNA(tx2gene), !anyDuplicated(tx2gene$transcript_id))
txi <- tximport(files, type = "salmon", tx2gene = tx2gene,
                 countsFromAbundance = "no")
stopifnot(identical(colnames(txi$counts), rownames(meta)))
dds <- DESeqDataSetFromTximport(txi, colData = meta, design = ~ condition)

这条路线通过完整对象向 DESeq2 传递估计计数与长度相关信息；不要又手动对矩阵做一次长度缩放，造成重复校正。countsFromAbundance 的不同选项有不同下游约定，本文只展示 no 加专门构造器的一条路线。转录本映射缺失、版本号不匹配、一个转录本映到多个基因等必须调查并记录；模板的结构校验不能替代参考来源审计。tximport 官方方法说明

~ condition 仅用于已经确认的简单独立设计。真实配对或批次实验应携带相应字段、检查设计并替换公式，不能因为换了导入入口就忘了配对关系。3′ 标签型 RNA-seq 的定量和长度处理也可能不同，应查相应协议，而不是把本模板视为所有 RNA 测序的标准答案。

7. 看到 NA 和报错，先判断原因

结果出现 NA，不应直接全部改为 1 或删除。全零、异常计数或独立过滤可能造成不同字段不可用，含义不一样。需要分别记录是否拥有检验 p 值和调整后 p 值，再按定义决定候选集或富集背景。报出非满秩时，优先检查完全混杂、没有样本的因子水平和冗余协变量，而不是不断删变量直到成功。

如果两组没有明确分开，也不要立即重做模型。样本差异可能主要由来源、细胞组成、时间或其他真实因素驱动。先回到原始 QC 与元数据，再解释探索图。计数模型加入 batch 与在展示图上去除 batch 是不同的事情；后一种视觉处理不能创造前一种设计里缺失的信息。

8. 本篇的自检与交付

在教学副本中，读入元数据后、按 ID 对齐之前插入 meta <- meta[rev(rownames(meta)), , drop = FALSE]。保留随后按 ID 对齐的那行时，顺序检查应通过，因为程序已经正确恢复匹配；再注释掉 meta <- meta[colnames(cts), , drop = FALSE]，顺序检查才应阻止继续。这是在验证对齐逻辑，不是在修改真实分组。把 condition 的参考水平反过来，检查 resultsNames() 与你指定的对比方向有何区别。构造全部对照在 B1、处理在 B2 的元数据，检查设计矩阵秩，练习解释为什么这是设计问题。

正式交付至少应有输入来源、过滤规则、模型公式、参考水平、对比清单、完整结果表、NA 的处理说明、实际会话版本与 QC 记录。保留整张表，而不只保留显著基因；未来改变阈值或重查某个候选时，才不必依赖截图猜测。

上一章：实验设计、FASTQ 与计数；下一章：QC 图、功能富集与结果解释。

官方与原始方法参考

• airway：公开教学数据与实验背景
• DESeq2：官方分析教程
• DESeq2：函数手册
• Love、Huber 与 Anders，2014：DESeq2 原始论文
• tximport：导入与长度处理
• R：多重比较调整
• Bioconductor：安装与版本兼容

这是三篇连续教程的第一篇，讨论常规 bulk RNA-seq：每个文库代表一个组织、细胞群体或其他整体样本。它不是单细胞教程，不能直接套到带有细胞条形码和 UMI 的单细胞矩阵上。本文中的六样本设计是原创的假设练习；命令只是准备好真实数据之后的执行模板，写作过程中没有在本机下载 FASTQ、安装软件或运行测序流程。

读完这一篇，应该能交付样本表、参考文件清单、处理参数、质控记录，以及来源明确的计数或定量结果。下一篇再用官方公开的小数据集练习差异表达，而不是让入门电脑先承担完整人类基因组比对。

1. 先画出实验单位，而不是先数文件

假设我们研究某种培养细胞在处理前后是否出现转录变化。三个独立培养来源进入对照组，另三个独立培养来源进入处理组，这里共有六个生物学重复。若同一个培养来源被分装后重复建库，重复的文库提供的是技术层面的信息，不能自动变成多个独立生物学重复。测了两个 lane、得到 R1 和 R2、把一个样本重复测序，也都不会把生物学样本数量翻倍。

我会先在纸上给每个样本写四项：它来自谁、接受什么处理、在哪个批次建库、与其他样本共享什么来源。这样可以提早发现两个危险情况：两组其实各只有一个独立来源；或者所有对照都在第一批处理、所有处理都在第二批处理。第一种缺少组内变异信息，第二种把处理与批次完全绑在一起。再复杂的统计软件也不能凭空补出缺失的实验信息。

“每组至少三个”可以作为入门设计练习的起点，却不是通用功效保证。正式实验应根据预期效应、变异、研究目标和资源做功效评估，并尽量在处理、提取、建库与测序环节平衡或随机化分组。技术重复的处理方式以及配对设计也要提前记录，不应看到结果以后才决定。关于实验单位与伪重复，可参阅 Lazic 等人的原始方法文章。

2. 一张表给流水线，一张表给科学问题

流水线样本表负责告诉程序文件在哪里；生物学元数据负责告诉分析者这些文件代表什么。两张表通过稳定的 sample_id 连接，不能靠“应该是这个顺序”连接。

下面是六个假设样本的元数据。subject_id 在这里表示独立来源，不是患者姓名；所有字段都只是教学标签。B1 与 B2 都有两个条件，但分配并不完全均衡，正式设计还可以进一步改善。

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sample_id,subject_id,condition,batch
C1,demo_01,control,B1
C2,demo_02,control,B2
C3,demo_03,control,B1
T1,demo_04,treated,B1
T2,demo_05,treated,B2
T3,demo_06,treated,B1

本系列固定参考 nf-core/rnaseq 3.27.0 文档，不用“最新版”代替版本记录。该版本 FASTQ 样本表必需的四列是 sample,fastq_1,fastq_2,strandedness。双端填写 R1/R2，单端的 fastq_2 留空。同一样本多个 lane 可以重复使用同一个 sample 标识，但不同生物学样本不能因此被意外合并。未知链特异性可设 auto，并在输出后复查推断与协议是否一致。3.27.0 官方样本表说明

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sample,fastq_1,fastq_2,strandedness
C1,/data/fastq/C1_R1.fastq.gz,/data/fastq/C1_R2.fastq.gz,auto
C2,/data/fastq/C2_R1.fastq.gz,/data/fastq/C2_R2.fastq.gz,auto
C3,/data/fastq/C3_R1.fastq.gz,/data/fastq/C3_R2.fastq.gz,auto
T1,/data/fastq/T1_R1.fastq.gz,/data/fastq/T1_R2.fastq.gz,auto
T2,/data/fastq/T2_R1.fastq.gz,/data/fastq/T2_R2.fastq.gz,auto
T3,/data/fastq/T3_R1.fastq.gz,/data/fastq/T3_R2.fastq.gz,auto

/data/fastq/ 是需要自行替换的路径，博客并未提供这些 FASTQ。真实元数据还应携带组织、采样时间、建库方式、poly(A) 富集或 rRNA 去除、读长、性别等与研究有关的字段。只填写实际已知的信息，不要用猜测补空格。涉及人类数据时，先确认数据使用范围；未经允许不要把 FASTQ、真实身份映射或临床字段上传到云服务及公开仓库。

3. 完整小练习：仅检查设计，不处理测序数据

下面的 Python 标准库代码可以单独保存为 check_rnaseq_design.py，使用 python check_rnaseq_design.py 执行。它只读取代码里的教学 CSV，不访问磁盘中的实验数据、不安装包、不生成差异基因。

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import csv
import io
from collections import Counter, defaultdict

text = """sample_id,subject_id,condition,batch
C1,demo_01,control,B1
C2,demo_02,control,B2
C3,demo_03,control,B1
T1,demo_04,treated,B1
T2,demo_05,treated,B2
T3,demo_06,treated,B1
"""
rows = list(csv.DictReader(io.StringIO(text)))
required = {"sample_id", "subject_id", "condition", "batch"}
if not rows or not required.issubset(rows[0]):
    raise ValueError("Missing metadata fields")
if any(not row[field].strip() for row in rows for field in required):
    raise ValueError("Blank metadata field")
ids = [row["sample_id"] for row in rows]
if len(ids) != len(set(ids)):
    raise ValueError("Duplicate sample_id")
groups = defaultdict(set)
batches = defaultdict(set)
for row in rows:
    if row["condition"] not in {"control", "treated"}:
        raise ValueError("Unexpected condition")
    groups[row["condition"]].add(row["subject_id"])
    batches[row["batch"]].add(row["condition"])
if set(groups) != {"control", "treated"}:
    raise ValueError("Both conditions are required")
if any(len(subjects) < 3 for subjects in groups.values()):
    raise ValueError("This teaching design requires 3 independent sources per group")
if any(n > 1 for n in Counter(row["subject_id"] for row in rows).values()):
    raise ValueError("Repeated source: review pairing or technical replication")
if all(len(conditions) == 1 for conditions in batches.values()):
    raise ValueError("Batch and condition may be fully confounded; review design")
print("Teaching design check passed")
print("Independent sources:", {k: len(v) for k, v in groups.items()})
print("Conditions represented in each batch:", dict(batches))

这段检查故意只接受“每个来源仅出现一次”的教学非配对设计。真实配对数据会被它要求人工复查，而不是被直接判定为坏数据。批次检查也是保守提示，不代替正式设计矩阵的秩检查。第二篇会展示配对建模与完整秩检查。

可以做三个自检：把 T3 的来源改成 T2 的来源；把全部 C 样本放到 B1、全部 T 样本放到 B2；把 C2 的 ID 改成 C1。观察程序在哪一步停止，并用自己的话解释停止原因。这个练习的价值是让“样本表错误”在昂贵的运算开始前被发现。

4. 参考基因组与注释必须是一套可追溯的东西

FASTA 告诉比对器参考序列是什么，GTF 告诉计数或转录本构建过程哪些区间属于哪些基因和转录本。二者不能只因为都写着“human”就视为匹配。需要核对物种、组装版本、注释发布版本、染色体命名、是否包含替代 contig，以及转录本 ID 是否与定量索引一致。

一个经常被忽略的错误是：比对使用带 chr 的 FASTA，注释却使用不带 chr 的 contig；另一个是用某个发布版本的转录组建索引，却拿另一个版本的转录本到基因对应表做汇总。程序有时可以继续运行，但有些读段或转录本已经悄悄失去了正确对应关系。不要在不理解来源的情况下统一删掉 ID 后缀，或者将缺失映射全部填成同名基因。

我建议保存一份参考清单，列出来源网址、下载日期、组装版本、注释版本、文件校验值、索引构建命令及工具版本。后面换参考文件时，把它当成一次新的分析决定，而不只是“更新了文件”。相关参数可在 nf-core/rnaseq 3.27.0 参数页逐项核对。

5. 从 FASTQ 到计数，各步骤究竟改变了什么

可以把流程记成一条有审计点的链：原始 FASTQ → 原始读段检查 → 必要的接头处理 → 比对或转录本定量 → 样本汇总 QC → 基因级输入检查。每个箭头都应该能回答“输入是什么、参数是什么、输出在哪里、为什么允许进入下一步”。

STAR 基因组比对保留读段的基因组位置，方便检查剪接、比对分布和其他 BAM 层面的指标；Salmon 估计转录本丰度，再依据转录本到基因的映射汇总。它们不是“哪个名字更高级”的关系，选择要对应目标、资源和实验协议。普通初学者可以先使用固定的标准工作流，掌握每个产物，再决定是否需要改变流程。nf-core 的比对和定量选项

下面模板选择 star_salmon。这不是对本机资源的可运行承诺。执行前需要可用的 Nextflow、与该版本要求匹配的 Java、Docker 或经管理员批准的容器运行环境、足够的 CPU/内存与磁盘，并确认镜像和参考下载权限。人类全基因组 STAR 工作不能按“普通小脚本”估计内存；具体资源应按参考、索引与集群政策规划。Nextflow 安装与运行前提以 官方说明为准。

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# Linux/HPC 执行模板：先替换路径并完成环境、权限和资源检查。
# 会读取真实FASTQ并产生大量文件；不是本篇已执行的练习。
nextflow run nf-core/rnaseq \
  -r 3.27.0 \
  -profile docker \
  --input /data/project/metadata/samplesheet.csv \
  --fasta /data/reference/genome.fa \
  --gtf /data/reference/annotation.gtf \
  --aligner star_salmon \
  --outdir /data/project/results/rnaseq_v1 \
  -work-dir /data/project/work/rnaseq_v1 \
  -with-report /data/project/nextflow_report.html \
  -with-trace /data/project/nextflow_trace.tsv \
  -with-timeline /data/project/nextflow_timeline.html

首次运行应使用新的结果目录，记录完整命令与退出状态。在 HPC 上不要在登录节点启动大任务；采用站点批准的执行器和资源配置。-resume 是恢复符合缓存条件的任务，不是自动确认旧参考、旧参数与新实验相容。正式分析还应记录实际 Nextflow、容器版本和镜像标识；只有 -r 固定了流程版本，其他外部配置也需要追踪。

6. QC 不是追求所有按钮都变绿

第一层看原始读段：数量、长度、质量下降位置、接头、过度代表序列。第二层看处理后信息：比对率、唯一/多重比对、rRNA 或其他污染、链特异性、插入片段、基因体覆盖与定量分配。第三层看样本之间：同一实验的样本是否有异常深度、异常分布，是否与建库记录一致。

RNA 读段来自不均匀表达的转录本，重复序列的解释不能机械照搬均匀覆盖的 DNA 测序。接头、低复杂度、过度扩增等也需要结合协议与其他证据区分，不要因一个警告就随意删掉全部重复读段。FastQC 提供的是待解释的线索，而不是替分析者完成决定。FastQC 官方概览、官方过度代表序列说明

MultiQC 把多个工具的报告集中展示，方便发现某个样本与同批其他样本不一致；它并不会替代实验协议、阈值依据和异常原因调查。MultiQC 官方说明

不要在这里给自己设置一个跨物种、跨协议的万能比对率阈值。应预先约定可接受范围和调查流程：发现问题后先查文件配对、参考、链特异性与污染，再结合原始记录判断是否重做。确有失败文库可以排除，但理由应与预先约定的 QC 依据相符，不能只因为排除后分组更好看。

7. 什么可以交给 DESeq2，什么不可以

基因整数计数、Salmon 的估计计数、TPM、VST 是不同对象。整数计数可以通过计数矩阵入口进入 DESeq2；Salmon 转录本估计通常用 tximport 或 tximeta 的专门入口，保留长度相关信息。TPM、FPKM、对数表达或 VST 值不能直接冒充原始计数。把 TPM 四舍五入也不会把它变回测序计数。DESeq2 输入说明

查看 Salmon 结果时，至少保留原始每样本 quant.sf、定量索引来源与 tx2gene 映射。计数矩阵必须附带生成方法；不能从几个名为 counts 的文件里凭名字选一个。nf-core 的输出包含原始估计计数、TPM、长度和不同缩放产物，选择下游入口时需要查看准确含义，而不是把所有列统称为“表达量”。3.27.0 输出文件说明

最终的交接包应含样本元数据、参考清单、原始计数或完整定量文件、流程与软件版本、QC 报告、异常处理记录，并明确哪些样本允许进入差异分析。若生物重复不足、关键标签存疑或处理与批次完全混杂，正确结果可能是“暂不进行差异检验”，不是强行产出火山图。

8. 本篇结束时的自查清单

• 我能说清实验单位，并区分生物学重复、技术重复、lane 和双端读段。
• 两张样本表使用相同稳定 ID，参考、索引和注释有精确来源。
• 链特异性有协议依据或经过推断复核，而不是从文件名猜测。
• 我知道每个输出是计数、估计丰度还是转换值，没有将 TPM 交给计数模型。
• 每次排除与重跑都有原因、版本和日志，可以追溯到原始输入。

下一篇：DESeq2 设计公式、对比与可复查的差异表达练习。

参考与继续阅读

• nf-core/rnaseq 3.27.0：用法
• nf-core/rnaseq 3.27.0：参数
• nf-core/rnaseq 3.27.0：输出
• Nextflow：安装与运行前提
• DESeq2：官方分析教程
• tximport：转录本定量导入

本文继续讨论 bulk paired-end ATAC-seq，沿用两组各三个独立生物学重复、非配对的学习设计。唯一可以直接运行的小练习使用人工数据，只检查结构和计数约定；真实 BAM 计数及 DESeq2 部分是资料准备完成后的模板，本文没有运行真实测序分析，不提供杜撰的差异区域数量、p 值或图。

一、先过 QC 门，再问差异

统计软件不会因为样本被错标、两组使用不同过滤标准而自动阻止分析。开始之前，要回看比对、重复率、线粒体比例、片段长度结构、TSS 富集、FRiP 与重复一致性，并确认每项指标使用的输入和单位。阈值需要结合协议、组织与实验背景；不能把一个固定数当作所有文库的通行证。

QC 失败、身份存疑或有效生物学重复不足时，先调查，必要时只保留描述性结果。不要为了让 PCA 分组漂亮而删样本；排除应有独立的技术证据、记录，并重新检查排除后的设计。把同一个样本的 lane、R1/R2 或 pooled BAM 当作新增重复，不能增加独立实验单位。

本例的三个重复是教学约定，不是充分功效保证。真实设计还要根据变异、目标效应和研究目的考虑样本量；只有一个来源每组一次时，不应套模板产生看似正式的显著性结论。DiffBind 官方教程将计数、质量检查、设计与归一化分开讨论，也适用于理解 ATAC 数据的这些边界。

二、每个样本必须站在同一张区域地图上

比较矩阵的行应来自一个固定的候选区域集合，列对应所有保留的独立样本。先根据明确规则建立 consensus regions，再在这些相同坐标上对所有样本计数。某个样本没有在该处叫到峰，也要在同一区域读取它的计数，而不是将该格直接填成零或缺失。

沿用 nf-core/atacseq 2.1.2 的 Bowtie2、narrow peaks 学习路线，可在 bowtie2/merged_library/macs2/narrow_peak/consensus/ 查看统一区域及相关计数材料。但这里的流程输出是起点，不是对所有实验设计的完整统计承诺。固定版本输出说明

要保存候选集合的生成规则、原始峰来源、重复支持要求和最终 BED 校验值。合并区间会改变宽度和计数机会；改成固定宽度的 summit 窗口则是另一个分析定义，需要重新计数并记录。不能让处理组用自己的峰宽、对照组用另一套峰宽，再把两个表按最近位置拼起来。

参考 FASTA、BAM header、BED、blacklist 和后续注释必须属于同一组装并使用一致的 contig 名称。chr1 与 1 不匹配不是小排版问题。BED 的零起点半开区间与 SAF 的坐标约定也不能混用；转换时保留 region ID，并用已知小区间验证边界。blacklist、线粒体与低质量比对过滤应采用同一规则，记录删除了什么；不能只在某一组移除可疑区域。

三、一条双端片段不能被 R1 和 R2 算成两次

本章选择片段级计数：同一有效 read pair 在一个区域内贡献一次，不将两端各算一个观察。不要将切点数、覆盖碱基总和、CPM、bigWig 信号或峰的富集分数混称为原始片段计数。沿用上一章的片段主线，不再额外给 BAM 叠加 Tn5 shift；另做切点或 footprint 分析时使用单独派生文件及明确校正记录。

“计数为整数”只是必要检查，不能证明计数单位正确。一个长片段可能命中多个区域；应在分析前决定是排除歧义分配、唯一分配，还是采用明确记录的多区域策略。本章的严格教学约定是：排除歧义分配，保留的片段只归一个 region，从而不会跨行重复累计。真实方法可以不同，但所有样本必须一致，不能临时为某个区域选择最有利的规则。

特别注意固定流程配置中的 -O --fracOverlap 0.2：-O 允许多区域分配，--fracOverlap 是重叠比例要求，不等于分数权重开关。两者不能证明一个片段只出现于一行；是否产生分数计数还要核对其他参数与实际输出。不要盲目四舍五入小数，也不要把整数多重分配误称为唯一分配。2.1.2 计数配置源码、featureCounts 作者说明

下面是准备完成后才可运行的重新计数模板，不是复刻上面的流程默认值。它面向已过滤、索引完整且参考一致的双端 BAM；使用支持这些参数的 Subread 版本并记录 featureCounts -v。所有占位输入必须预先核验。-p --countReadPairs 明确片段计数，-B -C 排除指定不完整或异常配对，未加 -O 或 --fraction，歧义多区域分配不保留。实际重叠判据依据 featureCounts 的配对比对语义，不应声称它必然覆盖 insert 内的每个碱基。

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# PREPARED INPUTS ONLY. No installation, alignment or peak calling here.
# consensus.saf has one unique region ID per region; coordinates validated.
# All six BAMs are independent samples, already filtered with the same policy.
atac_count_dir="$(mktemp -d "$PWD/atac-count-XXXXXX")" || exit 1
featureCounts -T 4 -F SAF -s 0 \
  -p --countReadPairs -B -C \
  -a /data/project/consensus.saf \
  -o "$atac_count_dir/counts.featureCounts.txt" \
  /data/project/bam/CONTROL_REP1.bam \
  /data/project/bam/CONTROL_REP2.bam \
  /data/project/bam/CONTROL_REP3.bam \
  /data/project/bam/TREATMENT_REP1.bam \
  /data/project/bam/TREATMENT_REP2.bam \
  /data/project/bam/TREATMENT_REP3.bam

这段只为本次计数创建全新目录，不删除任何数据。需检查退出状态、summary 中的成功与失败分配原因，并保留日志及参数。输出含注释列和 BAM 路径列名；导出下游矩阵时只保留计数列，按明确的一对一 BAM→sample ID 对照重命名，不能直接将整张 featureCounts 表当作数值矩阵。Subread 用户手册解释了双端计数、重叠分配和 SAF 输入的细节。

四、可直接运行的小练习：身份、边界和计数审计

以下只需要 Python 3 标准库，不读真实文件、不安装软件、不写磁盘。三个区域和十八个数都是人为构造，只用于验证结构。我们故意打乱元数据的顺序，程序按 sample ID 恢复对应关系。人工片段台账中每个 pair 只分配一个区域；重复写入同一 pair 会被拒绝。

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from collections import Counter, defaultdict

samples = ["CONTROL_REP1", "CONTROL_REP2", "CONTROL_REP3",
           "TREATMENT_REP1", "TREATMENT_REP2", "TREATMENT_REP3"]
conditions = ["control"] * 3 + ["treated"] * 3
batches = ["day1", "day2", "day1", "day1", "day2", "day2"]
metadata = [dict(sample_id=s, biological_id=f"demo_{i + 1}",
                 condition=c, batch=b, qc_pass=True)
            for i, (s, c, b) in enumerate(zip(samples, conditions, batches))]
metadata = list(reversed(metadata))
regions = [("region_01", "chr1", 100, 200),
           ("region_02", "chr1", 400, 500),
           ("region_03", "chr2", 100, 200)]
counts = [[10, 11, 9, 14, 12, 13],
          [20, 18, 21, 19, 22, 20],
          [5, 6, 4, 5, 7, 6]]

assert len(samples) == len(set(samples))
assert len(metadata) == len(samples)
assert len({r["sample_id"] for r in metadata}) == len(metadata)
assert {r["sample_id"] for r in metadata} == set(samples)
by_sample = {r["sample_id"]: r for r in metadata}
aligned = [by_sample[s] for s in samples]
assert [r["sample_id"] for r in aligned] == samples
assert all(r["qc_pass"] is True for r in aligned)
assert len({r["biological_id"] for r in aligned}) == len(aligned)
assert {r["condition"] for r in aligned} == {"control", "treated"}
assert all(n >= 3 for n in Counter(r["condition"] for r in aligned).values())
batch_conditions = defaultdict(set)
for row in aligned:
    batch_conditions[row["batch"]].add(row["condition"])
# This is a conservative teaching check, not a general design-rank test.
assert all(v == {"control", "treated"} for v in batch_conditions.values())

assert len({r[0] for r in regions}) == len(regions)
for region_id, chrom, start, end in regions:
    assert region_id and chrom in {"chr1", "chr2"}
    assert type(start) is int and type(end) is int and 0 <= start < end
for i, a in enumerate(regions):
    for b in regions[i + 1:]:
        assert not (a[1] == b[1] and a[2] < b[3] and b[2] < a[3])
assert len(counts) == len(regions)
assert all(len(row) == len(samples) for row in counts)
assert all(type(n) is int and n >= 0 for row in counts for n in row)

# Synthetic, already uniquely assigned pairs; not a BAM parser.
assignments = []
for (region_id, *_), row in zip(regions, counts):
    for sample, n in zip(samples, row):
        assignments.extend((sample, f"{region_id}_pair_{j}", region_id)
                           for j in range(n))
pair_keys = [(s, pair_id) for s, pair_id, region_id in assignments]
assert len(pair_keys) == len(set(pair_keys)), "Repeated pair assignment"
recounted = Counter((region_id, s) for s, pair_id, region_id in assignments)
assert all(recounted[(region_id, s)] == n
           for (region_id, *_), row in zip(regions, counts)
           for s, n in zip(samples, row))
print("PASS: 3 synthetic regions, 6 independent sample IDs, matched metadata")
print("Synthetic matrix column totals:",
      dict(zip(samples, [sum(row[j] for row in counts) for j in range(6)])))

检查输出应包括 PASS 和列总量 35、35、34、38、41、39。这些数是代码练习答案，不是深度、FRiP 或生物学效应。这里的区间断言也仅检查这三个教学区域，不能代替真实参考、blacklist 与 BAM 的审计。

试着复制一条 assignment，重复片段断言应失败；把一个计数改成 2.5，整数断言应失败；删除一个元数据样本，集合匹配应失败。最后将所有对照改为 day1、处理改为 day2，批次断言应拒绝继续。这些练习帮助区分“程序可以算”与“比较有意义”。

五、设计公式必须对应真实实验单位

本例的 day1 包含 CONTROL_REP1、CONTROL_REP3、TREATMENT_REP1，day2 包含其他三个样本，两组都出现在两个批次。采用 ~ batch + condition 的加性模型，估计考虑批次后的共同处理系数，不估计批次×处理交互。两组各三个不同来源，因此不加入一个每样本唯一的 subject 因子；那会耗尽可估计的信息。

若真实实验是同一供者各有处理与对照，则应携带供者身份并审查 ~ subject + condition 等配对设计，而不是照抄本例。若所有对照来自 day1、所有处理来自 day2，处理与批次完全混杂；删掉 batch 变量只会隐藏问题，不能创造可识别的处理效应。设计矩阵满秩是必要条件，不保证样本量充分、不存在残余混杂或因果解释成立。

下面的 R 模板仅接收已完成上述审计的真实、全量统一区域原始整数片段矩阵。不要把三行人工数据接入它来计算科学显著性。准备 raw_region_counts.tsv（第一列 region ID，其余列为 sample ID）与 metadata.tsv（第一列 sample ID，另有 biological_id、condition、batch、qc_pass；QC 合格写 TRUE）。已有相容 R/Bioconductor 与 DESeq2 时才可运行，不自动安装。

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# PREPARED REAL DATA ONLY: never feed the three-region teaching matrix here.
if (!requireNamespace("DESeq2", quietly = TRUE)) stop("Prepare DESeq2 first")
suppressPackageStartupMessages(library(DESeq2))
cts <- as.matrix(read.delim("raw_region_counts.tsv", row.names = 1,
                           check.names = FALSE))
meta <- read.delim("metadata.tsv", row.names = 1, check.names = FALSE)
stopifnot(is.numeric(cts), all(is.finite(cts)), all(cts >= 0),
          all(cts == floor(cts)), all(cts <= .Machine$integer.max),
          nrow(cts) > 0L, ncol(cts) > 0L,
          all(nzchar(rownames(cts))), all(nzchar(colnames(cts))),
          !anyDuplicated(rownames(cts)), !anyDuplicated(colnames(cts)),
          !anyDuplicated(rownames(meta)),
          setequal(colnames(cts), rownames(meta)),
          all(c("biological_id", "condition", "batch", "qc_pass") %in% names(meta)))
meta <- meta[colnames(cts), , drop = FALSE]
stopifnot(identical(colnames(cts), rownames(meta)),
          !anyNA(meta), all(meta$qc_pass == TRUE),
          all(nzchar(trimws(meta$biological_id))),
          all(nzchar(trimws(meta$batch))),
          !anyDuplicated(meta$biological_id),
          all(meta$condition %in% c("control", "treated")))
meta$condition <- factor(meta$condition, levels = c("control", "treated"))
meta$batch <- factor(meta$batch)
stopifnot(nlevels(meta$batch) >= 2L, all(table(meta$condition) >= 3L),
          all(table(meta$batch, meta$condition) > 0L))
design_formula <- ~ batch + condition
x <- model.matrix(design_formula, data = meta)
stopifnot(qr(x)$rank == ncol(x), nrow(x) > ncol(x))
storage.mode(cts) <- "integer"
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(cts, colData = meta, design = design_formula)
keep <- rowSums(counts(dds) >= 10L) >= min(table(meta$condition))
stopifnot(any(keep))
dds <- dds[keep, ]
stopifnot(all(rowSums(counts(dds)) > 0L))

# Run this default normalization only after reviewing section 6's assumptions.
dds <- DESeq(dds)
res <- results(dds, contrast = c("condition", "treated", "control"), alpha = 0.05)
tab <- data.frame(region_id = rownames(res), as.data.frame(res), row.names = NULL)
out <- tempfile("perry-atac-de-", tmpdir = getwd())
stopifnot(dir.create(out))
write.table(tab, file.path(out, "treated_vs_control_all_regions.tsv"),
            sep = "\t", row.names = FALSE, quote = FALSE)
saveRDS(list(dds = dds, res = res, metadata = meta, design = design_formula,
             contrast = c("condition", "treated", "control")),
        file.path(out, "atac_bundle.rds"))
capture.output(sessionInfo(), file = file.path(out, "sessionInfo.txt"))
message("Prepared-data outputs saved to: ", normalizePath(out))

本模板主动要求交叉批次例子和独立来源，不是所有设计的通用入口。预过滤的计数阈值与最小组样本数是预先声明的教学选择，应结合真实深度重新评估。保存的结果表对应进入模型的全部区域，而不是只保存显著行；原始计数、区域坐标和生成记录仍需另行归档。函数的计数入口、因子水平和显式 contrast 规则可与DESeq2 官方教程逐项核对。

六、归一化不是全局可及性测量仪

原始 counts 与测序深度有关，不能仅凭一列总数较大就宣称染色质整体更开放。常规的相对归一化依赖一组用于确定尺度的特征及其变化分布；大片区域同方向变化、处理引起细胞组成改变或建库效率改变时，尺度选择尤其需要审查。

如果研究问题是每个细胞的全局可及性变化，普通测序数据的相对组成不能自动提供绝对尺度。需要在实验阶段考虑可验证的外部控制、兼容协议的 spike-in、细胞数量与实验效率记录，或有充分依据的稳定参考区域；不能事后指定几个“看起来不变”的峰就声称问题已经解决。背景区域归一化也有自己的假设，不保证所有背景都稳定。DiffBind 提供多种归一化路线，选择工具本身不会消除这些判断。

应在结果解释前声明尺度依据，查看 QC、size factors、MA 图与其他诊断，必要时做有理由的敏感性分析。不能试遍归一化方式，只保留最符合预期的一套；更不能先对 counts 做 CPM，再把它送入原始计数入口。这一节也是上面的默认 DESeq2 模板的使用门槛，不满足时应暂停而不是硬跑。

七、看效应、精度和候选规则，不只看一颗星

本例固定 treated 相对 control 的方向：正 log2FC 表示在声明的模型与归一化尺度下信号更高。效应、标准误、p 值与 FDR 调整后的值回答不同问题；不显著不等于没有变化，低计数的大倍数也不自动值得优先解释。NA 可能与低信息、过滤或异常值有关，应追查原因，不能全部替换成零。

padj < 0.05 是声明模型下的多重检验规则，不是某个区域有“95% 概率真实”。普通检验后再按效应大小筛候选，不等于已经检验了“真实效应超过这个阈值”。可参考RNA-seq 第二章的设计与结果解释，其中统计概念能够借鉴，但 RNA 的计数单位与 ATAC 的归一化问题不能直接互换。

常见误区还有：峰出现／消失被当成定量差异；pooled BAM 被当成多个重复；图上不同自动纵轴被当成效应证据；整数矩阵被误当成正确片段矩阵。这些错误都可能得到漂亮结果，因而需要在结果之前检查，而不是靠图的美观程度判断。

八、从区域到机制，还有几道需要跨越的桥

motif 富集表示某类序列模式相对明确背景更集中，不证明对应转录因子在该条件下实际结合或激活。motif 家族相似、区域长度和 GC 背景都需要考虑；应记录候选与背景，而不是把一个富集名称当作功能结论。

最近基因注释只是位置上的关联，不等于已确认的调控靶点。远端区域可能作用于其他基因；ATAC 与 RNA 的方向一致可以帮助提出假设，却仍可能受到细胞组成、时间和共同上游因素影响。二者叠加并不会自动升级为因果机制，需要更具体的定位、时序、结合或干预证据。

最后的交付应能说清：比较哪几个独立实验单位、在哪套统一区域上按什么规则计数、QC 与归一化为何可信、设计和对比是什么，以及哪些结论只是待验证的解释。可重查的原始矩阵、区域 BED、元数据、参数、版本、完整表和排除记录，比只有一张火山图更有用。

上一章：从 FASTQ 到可审计的峰集合；课程起点：实验设计与质控口径。

官方参考与继续阅读

• nf-core/atacseq 2.1.2：consensus、计数与 QC 输出
• nf-core/atacseq 2.1.2：流程参数配置源码
• Subread：featureCounts 作者说明
• Subread：用户手册及配对、重叠、注释格式约定
• Bioconductor：DiffBind 官方教程，尤其归一化章节
• Bioconductor：DESeq2 官方计数输入、设计与 contrast 教程

这一篇的目标，不是记住一长串命令，而是让每个输出都能回答三个问题：它由什么输入产生，经过哪些转换，下一步允许拿它做什么。

一、把流程画成数据转换

双端 FASTQ 保存两端读段；比对后的 BAM 保存读段与参考坐标的关系；过滤后的 BAM 决定后续使用哪些有效信息；峰文件描述信号富集的区域；bigWig 用于浏览连续信号；统一区域计数表才是差异分析的输入候选。它们不是同一种数据的不同扩展名。

最容易出问题的地方，是只记住“最后生成了 peaks”，却不知道比较使用的是去重复前还是去重复后的 BAM，或将展示用的归一化信号误当成统计模型需要的原始计数。流程追踪要贯穿整个目录，而不是在结果末尾补一句“默认参数”。

本篇固定使用 nf-core/atacseq 2.1.2。固定的是学习示例的版本，不代表声称它永远是最新或适合所有协议。升级版本时应重新核对输入、过滤步骤、峰识别和计数参数，不能只改版本号。固定版本使用文档

二、运行之前，输入和资源都要明确

需要上一章的样本表、配对且完整的 gzip FASTQ、同一组装的 FASTA/GTF、匹配的 blacklist/TSS 注释，以及实际确认的线粒体名称。这里假设两组各有三个独立生物学重复，并以相同长度的双端 reads 测序。不同读长、不同参考和不同建库方案需要重新制定配置。

运行环境应有兼容该版本的 Nextflow、Java 和可用容器运行时。下面选用 Linux／WSL／集群环境中的 Docker profile，只是示例；受管理的计算集群应使用其允许的容器和调度配置。不要将它复制到尚未检查容器权限、磁盘和内存的环境里直接启动。大型参考建立索引及中间 BAM 可能占用较多资源，不能从“代码只有几行”推断任务很轻。

下面所有 /data 和 /refs 文件都是占位路径。GRCh38 是本例的参考选择，不是要求所有项目换成人类数据。

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nextflow run nf-core/atacseq -r 2.1.2 \
  -profile docker \
  --input /data/samplesheet.csv \
  --outdir /data/results/atacseq-2.1.2 \
  --fasta /refs/GRCh38.fa \
  --gtf /refs/GRCh38.annotation.gtf \
  --blacklist /refs/GRCh38.blacklist.bed \
  --tss_bed /refs/GRCh38.tss.bed \
  --mito_name chrM \
  --read_length 150 \
  --aligner bowtie2 \
  --narrow_peak \
  --min_reps_consensus 2 \
  --skip_merge_replicates

-r 与 -profile 属于 Nextflow 选项，使用单横线；--input 等属于流程参数，使用双横线。本例显式选择 narrow peaks，并关闭将同组生物学重复合并的附加分支，保留独立样本用于比较。--min_reps_consensus 2 是这个三重复教学设计的候选区域支持规则，需要按实际重复质量评估，不是通用最优值。--read_length 与有效基因组大小的处理有关；若显式提供 --macs_gsize，需要记录其来源和依据，而不是随便抄一个物种缩写。2.1.2 参数定义

不要为使峰数量增加就开启 --keep_dups、--keep_multi_map 或 --keep_mito。改变保留规则会改变可比性，必须有协议与研究问题上的理由。也不要为了省时间跳过关键 QC，然后把缺失的报告当成“没有异常”。

三、理解每个步骤在保护什么

接头剪切解决的是文库片段短于测序读长时的接头残留等问题，不是把所有警告修成绿色。比对把序列放到参考坐标上，但多重映射仍可能产生解释歧义。重复标记帮助识别可能重复测到的分子；它不能仅凭一个百分比判断整个实验是否失败。

技术 lane 可以合并到对应生物学样本，生物学重复则应保留独立身份。过滤还涉及配对关系、线粒体和不可靠区域。若两端之一被过滤，剩下的孤立 read 不能继续假装是一条完整片段。每一步的日志应回答“保留了多少、排除了多少、按什么规则排除”，否则看到有效数据减少时很难定位原因。

浏览信号轨道时，应核对归一化方式并让比较图使用一致的纵轴。自动缩放后的两个轨道都看起来很高，不意味着强度一样；局部位置也不能替代全局质控。峰识别进一步把连续信号变成区域集合，这一步受到深度、背景、参数和候选区域规则影响，因此峰数量不是独立于流程的自然常数。

四、Tn5 校正只做一次，而且先分清数据模型

ATAC-seq 常提到 Tn5 插入位点校正，但“做 ATAC 就在所有 BAM 上加 shift”是危险的简化。首先问下游想要的是真实双端片段，还是校正后的插入切点。这两个对象服务于不同的统计与可视化问题。

固定版本的 MACS2 模块使用 2.2.7.1，双端数据默认选择 BAMPE，从两端信息使用片段。本文沿用这条片段级峰识别路线，不另加外部 Tn5 shift，也不叠加单端切点路线的 --shift/--extsize 组合。2.1.2 MACS2 模块源码

如果另做 footprinting 或切点轨道，应从明确、未重复校正的来源生成单独的派生文件，记录谁负责校正、何时校正、使用什么工具与坐标约定。deepTools 的 alignmentSieve --ATACshift 有明确的双端位移定义；它不能被无差别加到本文主线中，更不能与已校正输入重复使用。alignmentSieve 文档

另一个常见错误，是把 --nomodel --shift -100 --extsize 200 当成“完成 Tn5 校正”的同义词。它描述的是另一种峰识别时的信号扩展方式，不等于插入位置校正；BAMPE 又有自己的片段语义。现代 MACS 官方文档明确区分这些输入模型，阅读时也应注意它讨论的是 MACS3，而本文流程固定的是 MACS2，不能借此悄悄换掉实现。MACS 输入模式与参数说明

五、结果目录应该能被解释

选择 Bowtie2 后，下游文件位于 bowtie2/。本例最值得寻找的是以下几类文件；具体前缀依样本和峰类型而定，不应硬猜完整文件名：

需要检查过滤前后 BAM 时，应预先决定是否保存中间比对文件；未保存的中间文件不应被文章或脚本假定存在。merged_library 在这里对应技术数据合并后的生物学样本，不等于把一组独立样本混成一个统计重复。2.1.2 输出说明

同时保存输入清单、运行命令、参数文件、软件版本、日志、参考校验值和必要的工作流信息。-resume 可以复用符合缓存条件的步骤，但它不是允许改动参考和参数却仍沿用旧结果标签的理由。改变方法后，结果标签和记录也必须能区分。

六、用四条假设片段理解 FRiP

以下练习完全是人工构造的区间：四条已经通过约定过滤的核基因组片段，两段不重叠的峰。使用 BED 的零起点、半开区间，片段只要至少命中一个峰就计一次。这个定义便于理解，但不是声称它复现了流程中的 FRiP 实现。

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fragments = [
    ("chr1", 100, 160),
    ("chr1", 180, 230),
    ("chr1", 500, 550),
    ("chr2", 100, 140),
]
peaks = [("chr1", 90, 170), ("chr1", 175, 240)]

def overlaps(a, b):
    return a[0] == b[0] and a[1] < b[2] and b[1] < a[2]

hits = sum(any(overlaps(fragment, peak) for peak in peaks)
           for fragment in fragments)
denominator = len(fragments)
print({"fragments_in_peaks": hits,
       "usable_fragments": denominator,
       "fragment_FRiP": hits / denominator})
assert hits == 2 and denominator == 4

预期是两条命中、四条作为分母，得到 0.5；这只是练习答案，不是文库质量结果。把第一段峰复制一份，答案仍应为两条，因为 any 保证同一片段不会重复累计。把第三条片段也包进一个新增峰，比例就会变化，说明 FRiP 既受数据影响，也受峰集合影响。

固定流程的 FRiP 模块使用映射 reads 的统计口径，而不是本练习的独立片段口径，还带有其重叠规则。因此不能把练习值与报告数值直接比较。真正记录时写清分子、分母、输入 BAM、过滤状态与峰集合；报告中不同工具的相似名称也不保证同一单位。流程 FRiP 模块源码

七、常见“运行成功但分析不成立”

样本名错误，可能把技术重复当成生物学重复；染色体命名不一致，可能让 TSS 或 blacklist 没有正确参与分析；组间使用不同过滤标准，可能制造技术差异；把 pooled BAM 当成多个独立样本，可能夸大置信度。这些问题并不一定触发软件错误。

还有两种解释层面的陷阱：把峰附近的最近基因当成确定靶基因，把 motif 富集当成该转录因子实际结合。峰注释和序列富集是生成待检验假说的入口，不是机制证据的终点。即便暂时只做浏览，也要将观察与推断分开写。

本篇的验收应是：样本映射无误、参考一致、过滤链可追踪、QC 可以定位到样本、独立重复仍被保留、峰和计数文件的单位明确。若样本质量不足或批次比较不可识别，可以保留描述性结果，但应停止差异推断。下一篇将使用这些材料学习差异可及性：从统一峰集合到明确统计问题。

本系列采用已核验的 nf-core/atacseq 2.1.2 作为流程学习入口。第一篇不急着运行峰识别，而是回答一个更早的问题：手里的数据，是否真的能够支持想做的比较？

一、先把“开放”说准确

ATAC-seq 利用转座酶对相对可及的染色质区域进行标记，随后从测序片段的分布观察染色质可及性。它提供的是一类测量信号，不是所有调控结论的直接答案。原始方法论文是理解实验原理的合适起点，而不是一份可以无条件照搬到所有组织的参数表。原始 ATAC-seq 方法论文

例如，某个区域在处理组中信号增高，可以暂时表述为“该区域的相对可及性发生变化”。此时还不能直接写成“某转录因子结合增强”，更不能凭最近的基因名称写成“这个基因导致了表型”。测量、统计比较、机制解释，是三层不同的问题。

开始前，建议先写四句话：比较的细胞或组织是什么；处理条件是什么；独立样本来自哪里；准备控制哪些已知混杂因素。如果这四句话写不清，后面的软件即使正常结束，也可能只得到一个漂亮但难以解释的结果目录。

二、生物学重复不是多几个 FASTQ

假设准备比较 CONTROL 与 TREATMENT，各有三个独立培养并单独制备文库的样本。这是每组三个生物学重复。如果同一个文库被分到两个测序 lane，两个 lane 增加的是技术测量，不是独立样本数。把它们当成两个重复，会夸大统计上的信息量。

在固定的 2.1.2 版本里，同一实验组使用相同 sample 标签，以 replicate 区分生物学重复；同一生物学样本的重复测序使用相同的两个标签。务必按该版本的输入语义填写，不要凭“每行就是一个独立样本”的直觉处理。nf-core 2.1.2 输入说明

下面是结构示例，路径只是占位符，必须换成实际可访问的文件：

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sample,fastq_1,fastq_2,replicate
CONTROL,/data/C1_R1.fastq.gz,/data/C1_R2.fastq.gz,1
CONTROL,/data/C2_R1.fastq.gz,/data/C2_R2.fastq.gz,2
CONTROL,/data/C3_R1.fastq.gz,/data/C3_R2.fastq.gz,3
TREATMENT,/data/T1_R1.fastq.gz,/data/T1_R2.fastq.gz,1
TREATMENT,/data/T2_R1.fastq.gz,/data/T2_R2.fastq.gz,2
TREATMENT,/data/T3_R1.fastq.gz,/data/T3_R2.fastq.gz,3

流程输入表之外，还需要独立的实验元数据表。建议保存 sample_id、condition、batch、donor、library_id、lane、protocol、read_length，并注明哪些字段未知。sample_id 可以采用流程输出的 CONTROL_REP1 等标识，但不能让一个样本在计数表、实验记录和质控表里出现三个不一致的名字。

三个重复只是这个教学设计的选择，不是任何项目都足够的承诺。样本异质性、预期效应和研究目标都会影响所需的独立样本数。ENCODE 的标准强调生物学重复与重复间一致性；这些要求比“把深度补足就行”更接近比较问题的核心。ENCODE ATAC-seq 数据标准

三、批次问题必须在比较前暴露

考虑两个假设设计。设计甲把所有对照在第一天建库、所有处理在第二天建库；设计乙在两天里都安排对照和处理。甲的处理条件与建库批次完全重合。发现组间差异后，无法仅凭现有数据判断来自处理还是建库日。把 batch 加进公式，不能凭空补出缺失的比较信息。

设计乙至少提供了同批次内的组间比较机会，但依然需要记录供体、细胞比例、建库步骤等因素。批次交叉不是免检证书。尤其是 bulk 数据，细胞组成变化也可能改变可及性图谱，不能将这种混合信号自动解释为同一种细胞内部的调控变化。

下面的标准库练习只使用内存中的虚构元数据，不读取测序文件，也不需要安装生信软件。它检查样本标识、重复数与批次交叉情况：

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from collections import Counter, defaultdict

rows = [
    ("CONTROL_REP1", "control", "day1"),
    ("CONTROL_REP2", "control", "day2"),
    ("CONTROL_REP3", "control", "day1"),
    ("TREATMENT_REP1", "treatment", "day1"),
    ("TREATMENT_REP2", "treatment", "day2"),
    ("TREATMENT_REP3", "treatment", "day2"),
]
ids = [sid for sid, _, _ in rows]
assert len(ids) == len(set(ids)), "Duplicate biological sample ID"
counts = Counter(condition for _, condition, _ in rows)
assert set(counts) == {"control", "treatment"}, "Both comparison conditions are required"
assert all(n >= 2 for n in counts.values()), "No replicated comparison"
by_batch = defaultdict(set)
for _, condition, batch in rows:
    by_batch[batch].add(condition)
for batch, conditions in sorted(by_batch.items()):
    print(batch, sorted(conditions))
if all(len(conditions) == 1 for conditions in by_batch.values()):
    raise ValueError("Condition may be completely confounded with batch")

把所有对照改成 day1、所有处理改成 day2，观察程序为什么停止。这个简化检查只能提示一种风险，不能代替第三篇中的设计矩阵满秩检查，更不能替代实验设计审查。

四、参考文件是一套坐标系统

至少需要匹配的基因组 FASTA 与基因注释，同时准备适用的 blacklist 和用于 TSS 统计的注释。不要把“人类参考”当成足够明确的版本说明：GRCh37 与 GRCh38 的坐标不能直接混用；同一组装的不同补丁、附加 contig 和染色体命名也需要核对。

建议把参考包写成一张清单：组装名称、FASTA 来源和校验值、GTF 发布版本、blacklist 的版本和适用组装、TSS 文件的生成规则、线粒体 contig 名称。chr1 与 1 不一致，可能让区域相交悄悄变成空集；线粒体叫 chrM 还是 MT，应从实际 FASTA 中确认，而不是凭记忆填。

blacklist 的作用是标记容易产生异常富集或不可靠解释的区域，不是删除“不符合预期”的结果。TSS 文件则定义统计中心的位置：基因、转录本的取舍以及重复 TSS 的处理，都可能影响富集曲线。换了参考定义，旧报告里的阈值就未必能原样比较。流程提供相关参考参数，但参数存在不等于参考文件已经匹配。nf-core 2.1.2 参考参数

五、质控是一条证据链，不是一个总分

先看原始 reads 的质量分布、接头和 R1/R2 完整性，再看比对与过滤损失，最后看信号结构和重复关系。高比对率不必然代表好文库：大量线粒体片段、重复片段或者背景片段也可以成功比对。只报告最终百分比，会隐藏信息在什么步骤丢失。

建议分层记录以下内容，并为每个数字写清输入文件和分母：

FRiP 需要特别小心。“峰内 reads / 可用 mapped reads”与“至少命中一个峰的独立片段 / 可用独立片段”不是同一个统计口径。还要说明峰集合来自单样本还是统一集合、是否去重复、是否去线粒体、采用何种重叠规则。若两个报告的分母不同，不能简单用数值大小评价文库优劣。TSS enrichment 也依赖所用注释、窗口和背景归一化定义。ENCODE 质控术语

ENCODE 给出了特定数据标准下的深度、FRiP、TSS 及重复一致性要求，可以作为参照，而不是所有样本的通用裁决器。组织、协议、参考注释及分析口径不同，阈值的适用性需要另行评估；既不能把边界值当万能通行证，也不能任意降低标准来保住想要的结果。

六、假设异常样本，怎样处理才有依据

设想一个处理组重复线粒体比例偏高、TSS 曲线平坦，同时与同组另外两个样本不一致。第一步不是删掉它，而是查配对关系、参考命名、实验记录和过滤日志。可以先排除文件错配、文库标识错置或参数差异。若问题仍在，记录哪些证据支持其质量不足，再按事先约定的规则作决定。

不能因为它使差异峰变少而删除，也不能只因 PCA 上距离远就断言它失败。如果剔除后某组不再有可用生物学重复，或者剩余样本令条件与批次完全混杂，就应停止该差异比较。还能保留描述性质控和探索图，但不要发布伪装成可靠推断的显著峰列表。

七、这一篇应留下什么

第一篇的输出不是峰，而是可审查的分析起点：输入文件清单、独立样本元数据、参考包清单、质控口径表和预先记录的继续／暂停条件。也应写下尚不知道的事项，例如供体关系未确认、某样本建库日期缺失，而不是用猜测填满表格。

进入下一篇前，自问：我能解释生物学重复与 lane 的区别吗？每个样本的 R1/R2 是否对应？参考文件是否采用同一坐标？各组是否有足够的可用独立样本？批次是否允许区分条件效应？FRiP 和 TSS 的定义是否已记录？如果任一关键问题未解决，先补证据，再运行更复杂的统计。

下一篇：从 FASTQ 到可审计的峰集合。最后一篇会把“统一区域、统一计数、明确模型”连起来：差异可及性不是比较峰数量。

这篇只搭建一个教学项目骨架，用六个虚构样本和三行人工计数练习元数据检查与日志记录。不下载真实 FASTQ，不调用比对或差异分析软件，不生成任何可用于解释真实生物学问题的结论。

1. 将来源、决定和结果分开

建议把原始输入、样本信息、配置、脚本、结果与日志分别保存。目录名字本身没有统一标准，关键是每一层职责清楚，其他人可以看懂。

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project/
  inputs/raw/        真实输入的存放位置；本练习留空
  references/        参考文件与版本说明；本练习留空
  metadata/          样本表
  config/            参数与处理约定
  workflow/          正式脚本及执行入口
  results/           可重新生成的产物
  logs/              运行与检查记录
  env/               运行环境信息

不要把未处理文件和经过过滤的文件都叫作 final.csv。也不要一边改输入，一边重跑同一个结果目录，却没有记录输入何时发生变化。

元数据是输入的一部分，不是可有可无的备注。至少需要稳定的样本 ID、实验条件、个体或生物学重复关系；视实验设计还需要批次、组织、采样时间、建库协议及其他协变量。真实患者信息不应直接写进公开仓库，匿名化标识也需要按适用的数据管理要求维护映射。

2. 完整示例：创建全新的教学项目

代码只使用 Python 标准库。保存为 create_learning_project.py，执行 python create_learning_project.py。程序使用 tempfile 创建新目录，所有写入都位于该目录；结束后保留文件供检查，不自动删除或访问现有项目。

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import csv
import hashlib
import json
import platform
import sys
import tempfile
from datetime import datetime, timezone
from pathlib import Path

root = Path(tempfile.mkdtemp(prefix="perry-rnaseq-"))
for relative in ["inputs/raw", "references", "metadata", "config", "workflow",
                 "results", "logs", "env"]:
    (root / relative).mkdir(parents=True, exist_ok=True)

samples = [
    {"sample_id": "C1", "subject_id": "demo_01", "condition": "control", "batch": "B1"},
    {"sample_id": "C2", "subject_id": "demo_02", "condition": "control", "batch": "B1"},
    {"sample_id": "C3", "subject_id": "demo_03", "condition": "control", "batch": "B1"},
    {"sample_id": "T1", "subject_id": "demo_04", "condition": "treated", "batch": "B1"},
    {"sample_id": "T2", "subject_id": "demo_05", "condition": "treated", "batch": "B1"},
    {"sample_id": "T3", "subject_id": "demo_06", "condition": "treated", "batch": "B1"},
]
sample_ids = [record["sample_id"] for record in samples]
metadata_path = root / "metadata/samples.tsv"
with metadata_path.open("w", encoding="utf-8", newline="") as handle:
    writer = csv.DictWriter(handle, fieldnames=list(samples[0]), delimiter="\t")
    writer.writeheader()
    writer.writerows(samples)

counts_path = root / "inputs/toy_counts.tsv"
rows = [
    ["teaching_gene_A", 10, 11, 12, 20, 21, 22],
    ["teaching_gene_B", 5, 6, 4, 7, 8, 6],
    ["teaching_gene_C", 1, 2, 3, 1, 2, 3],
]
with counts_path.open("w", encoding="utf-8", newline="") as handle:
    writer = csv.writer(handle, delimiter="\t")
    writer.writerow(["gene_id", *sample_ids])
    writer.writerows(rows)

config = {
    "schema_version": 1,
    "data_kind": "artificial_teaching_counts",
    "metadata": "metadata/samples.tsv",
    "counts": "inputs/toy_counts.tsv",
    "reference_release": None,
    "strandedness": "not_applicable_to_this_toy_table",
    "analysis": "column_totals_only; no differential testing",
}
(root / "config/project.json").write_text(
    json.dumps(config, indent=2, ensure_ascii=False) + "\n", encoding="utf-8"
)

# Read the files back: validation must check written input, not only Python variables.
with metadata_path.open(encoding="utf-8", newline="") as handle:
    records = list(csv.DictReader(handle, delimiter="\t"))
with counts_path.open(encoding="utf-8", newline="") as handle:
    table = list(csv.reader(handle, delimiter="\t"))

metadata_ids = [record["sample_id"] for record in records]
count_ids = table[0][1:]
assert len(set(metadata_ids)) == len(metadata_ids), "Duplicate sample ID"
assert metadata_ids == count_ids, "Metadata and count columns differ in order"
assert all(record["condition"] in {"control", "treated"} for record in records)
gene_ids = [row[0] for row in table[1:]]
assert len(set(gene_ids)) == len(gene_ids), "Duplicate gene ID"
totals = [0] * len(count_ids)
for row in table[1:]:
    assert len(row) == len(count_ids) + 1, "Wrong number of columns"
    assert all(value.isdecimal() for value in row[1:]), "Toy counts must be non-negative integers"
    for index, value in enumerate(row[1:]):
        totals[index] += int(value)

with (root / "results/toy_column_totals.tsv").open("w", encoding="utf-8", newline="") as handle:
    writer = csv.writer(handle, delimiter="\t")
    writer.writerow(["sample_id", "toy_column_total"])
    writer.writerows(zip(count_ids, totals))

manifest = {}
for relative in ["metadata/samples.tsv", "inputs/toy_counts.tsv", "config/project.json"]:
    manifest[relative] = hashlib.sha256((root / relative).read_bytes()).hexdigest()
(root / "config/input_sha256.json").write_text(
    json.dumps(manifest, indent=2) + "\n", encoding="utf-8"
)
environment = {"python": sys.version, "platform": platform.platform()}
(root / "env/python_environment.json").write_text(
    json.dumps(environment, indent=2) + "\n", encoding="utf-8"
)
log = {
    "recorded_at_utc": datetime.now(timezone.utc).isoformat(),
    "status": "PASS",
    "samples": len(count_ids),
    "genes": len(gene_ids),
    "analysis": "teaching input validation and column totals only",
}
(root / "logs/check.json").write_text(json.dumps(log, indent=2) + "\n", encoding="utf-8")
print("Project:", root)
print("PASS: samples=6 genes=3")
print("Toy column totals:", dict(zip(count_ids, totals)))

assert 在这里用于小练习的内部检查。运行时不要使用 Python 的 -O 优化选项，否则这些检查会被移除；正式流水线可以改成显式条件与异常，让校验成为不可跳过的执行步骤。

3. 核对几个真正有意义的结果

程序应给出六个样本、三个教学基因，列和依次为 C1=16、C2=19、C3=19、T1=28、T2=31、T3=31。它们只是人工整数的算术结果，不是测序深度质量判断，也不是差异表达证据。

打开 metadata/samples.tsv 与 inputs/toy_counts.tsv，确认样本顺序一致。真实工作中，一张表按照字母排序，另一张保持原始顺序，如果直接按位置拼接，可能悄悄把标签分配给错误样本。应按样本 ID 对齐并检查，不要只比较列数。

还要打开 logs/check.json，检查状态是否为 PASS；打开 config/project.json，确认它明确说明“教学计数、只求列和”。这能避免后来的人将演示产物误认为完成了真实分析。

SHA-256 用于检查记录的文件内容是否发生变化。它不证明数据来源可信，也不证明分析正确；如果文件变化，就需要说明为什么变化，并更新对应运行记录，而不是悄悄重写旧清单。算法接口见 Python 的 hashlib 官方文档。

4. 目录准备好了，还缺哪些真实分析信息

正式 RNA-seq 流程通常还需要数据来源与授权、读长与单端/双端信息、链特异性、质控规则、参考基因组及注释的精确版本、软件版本、线程和参数，以及计数或定量的具体方法。把这些记录在配置和环境文件中，比把软件名字写进 README 更具体。

原始整数计数与 TPM 不是可以任意互换的输入。本篇没有进行差异检验；如继续学习 DESeq2，需要按它要求的计数输入和实验设计构造对象，而不是把 TPM、VST 或 rlog 值当作原始计数交进去。基于转录本定量结果的导入也有专门流程，不能靠四舍五入 TPM 代替。详见 DESeq2 官方教程。

本例的六个 subject_id 都是不同的虚构个体。如果真实数据来自配对设计、重复时间点或复杂批次，样本表与统计设计都必须体现这些关系。复制一个模板不会自动得到正确的设计矩阵。

5. 环境文件和日志应该怎样补全

示例只记录了 Python 与操作系统，不包含真实生信软件清单。以后引入依赖时，可以在独立环境中安装并记录实际版本；Python 的环境隔离可参考 venv 官方文档。虚拟环境目录本身通常不是需要直接复制给其他人的交付物，版本、安装说明和复建方法更重要。

如果使用 R，应保留实际会话的 sessionInfo()；如果使用命令行工具，要记录完整命令、工作目录、起止时间、退出码，以及标准输出和错误日志。容器或锁定依赖有助于减少环境差异，但它们不能代替参考数据版本和分析参数。

将本次运行的脚本副本保存进 workflow/，并在自己的说明中记录执行入口。上面的校验清单只包含三个教学输入文件，没有自动跟踪后来添加的脚本；添加脚本或参考文件后，应扩展清单，而不是误以为它已经覆盖整个项目。

6. 常见误区与下一步练习

常见误区包括：结果表只有截图没有原始表；同一个样本在不同文件里采用不同名字；把技术重复当成独立生物学重复；只记“用了最新参考基因组”；把实际失败的运行与成功结果混进同一个日志目录。

可复查还需要解释性记录：排除某个样本的原因是什么？为什么改参数？新的运行相较旧运行改变了哪些输入？应写出判断依据，不只写“重新运行后正常”。

先做一个低风险练习：只在新教学目录里，把计数表的 T1 与 T2 两列交换，再执行下面的只读校验，确认样本顺序检查能够发现变化。再把一个样本 ID 改成重复值，观察唯一性检查是否触发。不要在真实输入上做这样的破坏性测试。

将检查保存为 check_saved_project.py，以创建脚本打印的完整目录为唯一参数运行。不要为了检查改过的文件而重跑创建脚本：它会生成另一个新目录，而不是读取你编辑的那一个。

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import csv
import sys
from pathlib import Path

if len(sys.argv) != 2:
    raise SystemExit("Usage: python check_saved_project.py PROJECT_DIRECTORY")
root = Path(sys.argv[1]).resolve(strict=True)
with (root / "metadata/samples.tsv").open(encoding="utf-8", newline="") as handle:
    samples = list(csv.DictReader(handle, delimiter="\t"))
with (root / "inputs/toy_counts.tsv").open(encoding="utf-8", newline="") as handle:
    counts = list(csv.reader(handle, delimiter="\t"))
ids = [sample["sample_id"] for sample in samples]
assert len(ids) == len(set(ids)), "Duplicate sample ID"
assert ids == counts[0][1:], "Sample columns do not match metadata order"
print("PASS: sample IDs are unique and ordered correctly")

最后给项目写一份很短的 README：这是教学数据还是正式数据、如何重新生成结果、成功时应检查哪些文件、哪些步骤尚未运行。这四句话能够阻止很多误解，也为之后接入真实 RNA-seq 工作流保留清晰边界。

官方参考

• DESeq2：计数输入、实验设计与差异表达分析
• Python：venv 环境隔离与创建
• Python：hashlib 与 SHA-256

在生物数据中，“一行”经常不是一个独立个体。一个人可以贡献多个时间点，一个供体可以贡献很多细胞，一个样本可以拆成许多片段。划分数据前，需要先回答：以后模型面对的新对象是什么？

这里选择的任务是泛化到未见过的个体，所以按照个体 ID 分组。示例全部使用人工生成的数字，不涉及真实受试者，不给出任何疾病预测结论；模型分数只用于检查程序能否运行。

1. 从评价对象倒推划分单位

如果未来要预测新供体，同一供体的记录不应同时出现在训练集和测试集。如果要评估未来时间点，随机混合过去与未来可能不合适。如果要推广到另一家中心，还需要按中心或外部队列进行额外评估。

按个体分组解决的是一种依赖结构，不会自动解决时间泄漏、批次混杂、标签错误和中心差异。一个 ID 列也不能替代研究设计。

下面用 GroupShuffleSplit，它按组生成索引；参数比例对应组的比例，而不是保证相同比例的记录数。组大小不等时，两者会不同。它也不保证标签分层，所以划分后仍要检查每一部分的类别分布。见 scikit-learn 的 GroupShuffleSplit 文档。

2. 安装与运行边界

示例需要 Python、NumPy、scikit-learn 与 PyTorch，使用 CPU 和小张量，不下载数据集。下面的安装命令在自己新建的空练习目录中执行；若当前目录已有 .venv，不要直接覆盖它。如果已有兼容环境，也不需要重新安装。

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python -m venv .venv
source .venv/bin/activate
python -m pip install numpy scikit-learn torch

这是 Linux/WSL 的激活写法。PyTorch 的具体安装方式会随平台变化，本文不要求 CUDA；记录你实际安装的版本，不把“相同随机种子”理解为跨设备、跨版本逐位相同。

将下一段保存为 grouped_training.py，执行 python grouped_training.py。代码只在内存中使用模拟数据，不覆盖磁盘上的模型或数据文件。

3. 完整代码：先分组，再拟合预处理

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import copy
import numpy as np
import sklearn
import torch
from torch import nn
from torch.utils.data import DataLoader, TensorDataset
from sklearn.model_selection import GroupShuffleSplit
from sklearn.preprocessing import StandardScaler

seed = 17
rng = np.random.default_rng(seed)
torch.manual_seed(seed)

# 24 synthetic people; each contributes 3 records with 6 features.
groups = np.repeat(np.arange(24), 3)
y = (groups % 2).astype(np.int64)
X = rng.normal(size=(len(groups), 6)).astype(np.float32)
X[:, 0] += y * 0.8  # An artificial signal, not a biological relationship.

outer = GroupShuffleSplit(n_splits=1, test_size=0.25, random_state=seed)
development, test = next(outer.split(X, y, groups))
inner = GroupShuffleSplit(n_splits=1, test_size=1 / 3, random_state=seed + 1)
train_local, valid_local = next(
    inner.split(X[development], y[development], groups[development])
)
train, valid = development[train_local], development[valid_local]

splits = {"train": train, "valid": valid, "test": test}
group_sets = {name: set(groups[index]) for name, index in splits.items()}
assert not (group_sets["train"] & group_sets["valid"])
assert not (group_sets["train"] & group_sets["test"])
assert not (group_sets["valid"] & group_sets["test"])
for name, index in splits.items():
    labels = np.bincount(y[index], minlength=2).tolist()
    print(name, "groups=", len(group_sets[name]), "rows=", len(index), "labels=", labels)
    if min(labels) == 0:
        raise ValueError("A split has only one class; revise the evaluation design.")
print("PASS: no person occurs in more than one split")

# Only training records estimate the scaler's parameters.
scaler = StandardScaler().fit(X[train])
scaled = {name: scaler.transform(X[index]).astype(np.float32)
          for name, index in splits.items()}
assert np.allclose(scaled["train"].mean(axis=0), 0, atol=1e-5)

train_data = TensorDataset(torch.from_numpy(scaled["train"]), torch.from_numpy(y[train]))
loader = DataLoader(train_data, batch_size=12, shuffle=True,
                    generator=torch.Generator().manual_seed(seed), num_workers=0)
model = nn.Sequential(nn.Linear(6, 16), nn.ReLU(), nn.Dropout(0.2), nn.Linear(16, 2))
optimizer = torch.optim.Adam(model.parameters(), lr=0.01)
criterion = nn.CrossEntropyLoss()

def evaluate(name):
    model.eval()
    features = torch.from_numpy(scaled[name])
    labels = torch.from_numpy(y[splits[name]])
    with torch.no_grad():
        logits = model(features)
        loss = criterion(logits, labels).item()
        accuracy = (logits.argmax(dim=1) == labels).float().mean().item()
    return loss, accuracy

best_loss, best_state, best_epoch = float("inf"), None, None
for epoch in range(1, 41):
    model.train()
    for features, labels in loader:
        optimizer.zero_grad()
        loss = criterion(model(features), labels)
        loss.backward()
        optimizer.step()
    valid_loss, _ = evaluate("valid")
    if valid_loss < best_loss:
        best_loss = valid_loss
        best_state = copy.deepcopy(model.state_dict())
        best_epoch = epoch

assert best_state is not None
model.load_state_dict(best_state)
test_loss, test_accuracy = evaluate("test")  # Final test evaluation: once.
print("selected_epoch=", best_epoch)
print(f"test_loss={test_loss:.4f} test_accuracy={test_accuracy:.4f}")
print("versions:", "numpy", np.__version__, "sklearn", sklearn.__version__, "torch", torch.__version__)

此处标准化只是演示连续特征的预处理边界，不是建议把所有 RNA-seq 计数直接交给这个网络。真实数据的表示方式、批次处理及任务标签需要单独确定。

4. 应该检查什么输出

这段数据设计固定了每个个体三行，所以三部分的规模应是：训练 12 个个体、36 行；验证 6 个个体、18 行；测试 6 个个体、18 行。还应打印 PASS: no person occurs in more than one split。

类别计数、选中轮次、测试损失与准确率由实际运行产生。本文不预设一个漂亮分数，也不把人工数据的表现解释为真实任务中的性能。改变平台或依赖版本后，训练结果可能变化；分组不重叠和只在训练集拟合标准化的原则不应改变。

state_dict() 中的张量可能继续随训练变化，因此这里对最佳状态做深拷贝，而不是仅保存一个引用。验证集负责选轮次，最终测试集没有进入这条选择过程。

评估时同时使用 model.eval() 和不计算梯度的上下文：前者调整 Dropout 等模块行为，后者避免构建训练用的梯度图。训练模式与评估模式的基本用法见 PyTorch 的参数优化教程。

5. 泄漏不只发生在划分这一行

先对全部样本计算均值、筛选特征，再拆训练集，会让测试数据影响处理规则。正确顺序是先划分，在训练数据上拟合，再把同一个变换应用于验证与测试；交叉验证中的每一折也必须重新拟合。参见 scikit-learn 对数据泄漏的说明。

同样危险的操作还有：用结局发生后的变量预测结局；将同一患者的记录通过不同 ID 引入不同集合；反复查看测试集后挑学习率；在全部数据上做有监督特征筛选；把数据增强产生的近重复样本分到两边。

这里只计算记录级准确率。一个个体有多条记录时，不应把这些记录当成相互独立的个体来估计不确定性。是否先聚合个体预测、如何按个体重采样，以及需要什么指标，取决于应用目标和研究设计。

准确率也不是唯一尺度。类别不平衡时，需要查看混淆矩阵、各类召回等；若使用概率，则还应考虑概率校准。阈值的选择需要发生在开发阶段，不能观察最终测试标签后再调整。

6. 练习：审计流程，不追求更高的数字

第一项练习是将三个集合的个体 ID 打印出来，手工核对交集为空。第二项是改成每人不同数量的记录，观察“组比例”和“行比例”如何分离。

第三项是检查一份自己的模型笔记：哪些步骤调用了 fit？这些步骤看到的是哪个集合？如果更改预处理、模型结构或训练轮次，是否又查看了测试集？把答案写成表格，比只记录最后一个分数更能说明实验边界。

不要为了让测试分数上升，反复随机划分直到遇到好看的结果。若需要评估划分敏感性，应预先确定重复划分或分组交叉验证方案，并按方案完整报告，而不是筛选最好的一次。

官方参考

• scikit-learn：GroupShuffleSplit 分组划分
• scikit-learn：预处理与数据泄漏
• PyTorch：训练循环与评估模式

这篇从一个非常小的计数任务开始。脚本只在自己刚创建的临时目录里生成三行教学数据，不读取真实测序文件，不移动用户文件，也不自动删除任何目录。先建立这样的安全边界，再把思路迁移到正式工作流。

1. 先约定脚本的职责

我们的任务是读取两列教学 TSV：第一列样本名，第二列非负整数。结果包括有效样本数和计数之和。

输入范围有意很窄：样本名只能包含英文字母、数字、下划线或短横线；计数是十进制整数；两列都不能为空。它不是通用 CSV 解析器，也不是对真实表达矩阵进行生物学分析。

如果以后需要处理带引号、空字段、复杂注释或数十万列的数据，应该使用 Python/R 的表格读取工具，不能假定一个 read 循环可以处理所有格式。

正式任务还需要补充三个问题：如果某个样本失败，其他样本是否继续？哪些文件可以覆盖？结果怎么判定完整？这些属于分析策略，应当在写循环之前决定，而不是等错误发生后临时猜测。

2. 四个值得保留的习惯

路径变量通常放在双引号里，避免空格被拆成多个参数。需要把字符串原样写出时，使用 printf '%s\n' "$value"，让格式串与数据分开。双引号与未引用变量的行为差别可查阅 Bash 的引用规则。

运行前明确输出目录。这里用 mktemp -d 创建新的目录，避免把“已有工作目录”误当成“本次练习目录”；不要用 mktemp -u 只猜一个名字。相关创建语义见 GNU Coreutils 的 mktemp 文档。

对预期内的失败显式处理，例如文件不存在或字段非法。对意外失败保留退出码和行号。只有“看到错误文字”不够：上游流程通常依据退出码决定是否继续。

尽量让每次运行产生独立结果。调试时保留失败现场，往往比写一个自动清理所有东西的退出钩子更有帮助。下面的程序结束后会打印练习目录，供你核对；它不会替你清理。

3. 完整练习：只在新的临时目录里工作

需要 Linux 或 WSL 中的 Bash 与 GNU Coreutils。请用编辑器将代码保存为 safe_counts.sh；保留 LF 换行，再执行 bash safe_counts.sh。不要把 bash 换成 sh：示例使用了 Bash 专属语法。

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#!/usr/bin/env bash
set -Eeuo pipefail
umask 077

on_error() {
  local status=$?
  printf 'ERROR: status=%s line=%s\n' "$status" "$1" >&2
  exit "$status"
}
trap 'on_error "$LINENO"' ERR

task_dir=$(mktemp -d --tmpdir perry-shell.XXXXXX)
printf 'Practice directory: %s\n' "$task_dir"
cd -- "$task_dir"

mkdir -- 'input files' 'results' 'logs'
input_file="$task_dir/input files/counts.tsv"
result_file="$task_dir/results/summary.tsv"
log_file="$task_dir/logs/run.log"

printf 'sample\tcount\nS1\t12\nS2\t0\nS3\t7\n' > "$input_file"
printf 'START\nworkdir=%s\nbash=%s\n' "$task_dir" "$BASH_VERSION" > "$log_file"

if [[ ! -s "$input_file" ]]; then
  printf 'Input is missing or empty: %s\n' "$input_file" >&2
  exit 2
fi

sample_count=0
total=0
line_number=0
record_pattern=$'^([A-Za-z0-9_-]+)\t([0-9]{1,6})$'
while IFS= read -r record || [[ -n "${record:-}" ]]; do
  line_number=$((line_number + 1))
  if [[ "$line_number" -eq 1 ]]; then
    if [[ "$record" != $'sample\tcount' ]]; then
      printf 'Unexpected header\n' >&2
      exit 2
    fi
    continue
  fi
  if [[ ! "$record" =~ $record_pattern ]]; then
    printf 'Invalid teaching record at line %s\n' "$line_number" >&2
    exit 2
  fi
  sample=${BASH_REMATCH[1]}
  count=${BASH_REMATCH[2]}
  # 10# makes zero-padded input decimal, not an octal literal.
  value=$((10#$count))
  sample_count=$((sample_count + 1))
  total=$((total + value))
done < "$input_file"

if [[ "$sample_count" -eq 0 ]]; then
  printf 'No data records\n' >&2
  exit 2
fi

printf 'samples\ttotal\n%s\t%s\n' "$sample_count" "$total" > "$result_file"
printf 'SUCCESS\nsamples=%s\ntotal=%s\n' "$sample_count" "$total" >> "$log_file"
printf 'CHECK: samples=%s total=%s\n' "$sample_count" "$total"
printf 'Result: %s\nLog: %s\n' "$result_file" "$log_file"
printf 'Practice files are retained; no automatic deletion was performed.\n'

它特意创建了含空格的 input files 目录。如果去掉路径变量外侧的双引号，程序就可能把一个路径拆成两个参数。这种小范围练习比直接拿真实项目试错更容易理解引用规则。

读取时先保留整行，再用固定的正则约定两列，避免把连续制表符错误地压成一个字段分隔符。每条计数最多六位数字，只为避免把任意长的字符串直接送入 Bash 整数运算；shell 算术不是无限精度计算器。读取条件还保留了文件末尾没有换行时的非空记录，避免最后一行被悄悄漏掉。

4. 检查输出，而不是只看终端有没有报错

临时目录尾部的随机字符每次不同，但关键检查行应为：

1

CHECK: samples=3 total=19

将终端打印的完整 Result 路径复制给 sed -n '1,5p'，应看到下面两行。路径需要放在双引号里；不要凭记忆拼接另一个临时目录。

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2

samples  total
3        19

上面的展示用空格方便阅读，文件实际用制表符分列。日志结尾应该出现 SUCCESS、samples=3 与 total=19。有结果文件但没有成功标记时，不应把它默认为完整产物。

更重要的是检查输入：三条记录是否正是 S1、S2、S3？有没有意外多读了一行？本例只累计计数，不检测重复样本名；正式任务需要额外验证唯一性。明确知道程序尚未检查什么，本身就是安全实践的一部分。

5. set -e 与 pipefail 不是万能保险

-u 帮助发现未设置变量；pipefail 让管道中较早命令的非零退出也能影响整个管道状态；-e 在部分失败场景中终止脚本。但 if 条件、某些 &&/|| 链和其他上下文有例外，不能把它理解成“所有错误一定会立即停机”。具体条件应查 Bash 的 set 内建命令说明。

还要注意 head 提前退出的问题。一个长输出被 head -n 10 截断时，上游程序可能收到 SIGPIPE；打开 pipefail 后，整条管道可能呈现非零状态，即使你只是想看前十行。这不代表输入文件必然损坏，也不应该习惯性加上 || true 隐藏所有异常。

只预览文本文件，可以直接用 sed -n '1,10p' "$input_file"；它不依靠另一个进程提前关闭管道。需要做“是否匹配”的判断时，把 grep 的退出状态放进明确的 if，区分未匹配与真正读取失败。对大型二进制数据或外部分析工具，先理解工具自身的退出码约定。

另一个小坑是 ((counter++))：当旧值是零时，算术命令的状态可能让 -e 触发。上面的脚本使用普通赋值 counter=$((counter + 1))，避免把计数的真假值混进错误处理。

6. 常见误区与练习

不要在未核对路径时批量重命名或删除；不要把任意文件名拼进一段 eval；不要一边读取原始文件，一边覆盖它；不要因为脚本有日志，就把未检查的结果称为可复现。

本例的 ERR 钩子提供诊断，不负责回滚已经写出的文件；它也不承诺覆盖所有信号与语法错误。可以先用 bash -n safe_counts.sh 做语法检查，但语法通过不等于逻辑正确。

完成后做三个小练习：把 S2 的计数改成 005，确认结果按十进制解释；在你自己的脚本副本里将一行计数改成 abc，确认程序拒绝输入；连续运行两次，核对两次目录不同且第一次的结果还在。

最后写下自己的检查清单：输入格式、样本唯一性、输出位置、覆盖策略、成功标记。把这些问题带到下一次真实分析里，比背下一长串 shell 命令更有用。

官方参考

• GNU Bash：引用规则
• GNU Bash：set 内建命令与错误选项
• GNU Coreutils：mktemp 创建临时目录

读论文时，一个困难并不是完全看不懂，而是看懂之后太快形成了一个更强的结论。图里出现了两组差异，就觉得机制已经被证明；模型给出较高的预测分数，就觉得它解释了原因；某项检验没有达到阈值，又把它概括为“没有作用”。

也许更有帮助的阅读习惯，是暂时把结论放慢半步：先说清看到了什么，再问这些观察最多能够支持什么。

观察、推断和解释，不要写在同一格里

假设一篇文章比较了两个条件下某个测量指标。图上可以直接读到的，是测得数值的分布、差异和不确定性。把它写成“在这些样本与测量条件下，观察到这样的变化”，比立即写成“这个因素决定了变化”更准确。

进一步说变化与某个因素有关，需要检查比较对象、分组方法和其他可能解释。若要主张因果机制，还需要相应设计或干预证据；一幅图的视觉说服力，不能替代这些条件。

可以把阅读笔记分成三格：

这不是要求每篇论文都回答所有层次，而是让自己的概括不要悄悄跳过一层。

在数样本以前，先问独立性

假设同一份样本产生了很多读段，或者同一个对象被测量很多次。数据点数量确实增加了，但它们是否代表同样数量的独立实验单位，需要根据采样和实验设计判断。

不能仅凭表格很长，就把每行都视为独立重复。对于这类问题，Lazic 等人的方法文章讨论了实验单位、观测单位及伪重复之间的区别，可作为核对设计的入口：What exactly is ‘N’ in cell culture and animal experiments?

阅读时可以依次问：处理分配给了谁？哪些观测共享同一个来源？分析有没有考虑这种结构？文中的 n 表示对象、样本、孔、读段，还是重复测量次数？

问题的重点不在于找一个尽可能大的数字，而在于数字是否对应研究结论所需的独立信息。

“没有发现差异”仍需要说明范围

假设一个比较没有得到足够明确的差异证据。可能确实不存在值得关注的变化，也可能当前数据噪声较大、样本不足，或者测量与问题没有充分对应。究竟更接近哪种解释，需要看效应估计、区间、设计与分析假设。

因此，“在当前数据和分析下，没有获得明确支持”通常比“已经证明完全没有影响”更谨慎。反过来，也不能借不确定性无限维护一个想法，声称只要再收集数据就一定能得到想要的结果。

美国统计协会关于 p 值的声明强调，单个阈值不应替代科学判断；p 值不直接表示假设为真的概率，也不衡量效应大小或结果重要性。阅读时应结合设计、估计和完整报告，而非仅把结果分成两类。见 ASA 官方声明。

对于需要证明“足够接近”或“不超过某个实际重要差异”的问题，也应先明确那个界限和合适的分析方案，而不是直接把一次不显著检验改名为“等效”。

一个好看的预测结果，回答的可能只是预测问题

再设想一个模型能区分两类样本。这个结果首先支持的是：在所用数据、划分方式与评价设置下，模型具有相应的区分表现。它不自动回答模型依赖了什么信息，也不自动证明某个特征具有因果作用。

如果训练集与测试集共享来源，或者预处理使用了全部数据，漂亮的指标还可能回答了一个比预期更容易的问题。评价一个模型时，先检查数据划分和可用信息，再讨论架构与分数。

这也提醒阅读者：作者提出的问题、实验实际回答的问题，以及自己想应用的问题，可能不是同一个。应用之前，应把这三者并排写一次。

允许笔记保留“不确定”

不确定并不等于没有进展。它可以被拆成很具体的任务：补充材料里有没有分组规则？置信区间覆盖多大的范围？另一种解释有没有被对照实验排除？这个结论能否推广到不同来源的数据？

与其用一句“还需要更多研究”结束，不如写出缺的是哪种证据。明确缺口以后，后续阅读才知道该寻找什么，而不是只寻找更多支持原观点的句子。

下次读到一个重要结论，检查这六项

1. 结论对应哪张图、哪组样本和哪种测量？
2. 比较对象与实验单位是什么？
3. 观察、推断和机制解释有没有被混写？
4. 效应有多大，不确定范围有多宽？
5. 阴性或不一致结果是否被如实报告？
6. 换一个来源或条件，结论还需要哪些证据？

谨慎不是把每个结论都稀释成“也许”。更有建设性的做法，是给结论配上清楚的范围、明确的依据，以及下一步可以检查的疑问。这样保留下来的不确定性，才有机会成为继续理解的起点。

一篇论文从第一页开始读，不一定就能顺着它的逻辑走到最后。摘要告诉人结论，结果展示很多图，方法铺开大量细节；读到末尾时，可能记得几个术语，却说不清作者究竟跨过了哪几个证据台阶。

一种值得尝试的思路，是不要先把论文当作一串需要全部记住的文字，而是当作一个需要重新搭起来的论证：问题是什么，作者怎样把问题变成可测量的任务，观察到了什么，哪些证据允许形成结论，还有哪些部分没有被回答。

读懂不等于同意。能够准确重建作者的论证，再判断它的力度，比一开始就寻找亮点或漏洞更有帮助。

第一轮：先找到研究问题，不急着收集所有细节

第一轮可以阅读摘要、引言末尾、主要图题和讨论中的限制部分。目的不是给论文打分，而是写出一个暂定的研究地图。

先用一句话说明问题。比如一篇假设的计算生物学论文，试图根据序列预测某种分子测量。它的核心问题可能不是“深度学习能不能用于生物学”，而是“仅凭这段序列，能否预测某个明确条件下的特征，并在没有见过的区域上保持一定表现”。

这句话立即带出几个需要回到正文核对的变量：序列窗口有多长？特征是什么？测量来自哪些条件？没有见过是什么意思？作者需要的是预测、解释，还是因果机制？

第一轮结束时只留下五项：研究对象、已有瓶颈、输入、输出、作者最重要的主张。不确定的地方用问号保留。此时没有必要查清每个网络层或缓冲液成分，否则细节很容易把问题本身遮住。

还可以做一个阅读优先级判断：这篇论文与当前问题的连接在哪里？是需要它的原理、评价方式、数据资源，还是一个具体操作？目的不同，第二轮需要投入最多时间的部分也不同。

第二轮：从结论倒推到证据，再按图重建顺序

第二轮围绕主要图展开，但不要仅复述每个子图的颜色和趋势。每张图应尽量回答四个问题：它测试哪条主张，比较的对象是什么，观察单位是什么，这个比较能排除哪些替代解释。

继续前面的假设案例。图一展示模型在留出数据上的表现，直接支持的是所用划分和评价下的预测能力；图二比较不同输入窗口，帮助讨论上下文信息的作用；图三展示某些序列改动后的预测变化，提供模型响应的线索。三类证据不应该被合成一句“模型已经证明调控机制”。

读到一张很漂亮的图时，可以先去掉作者的概括，只写能直接从坐标和比较中确认的内容。再把作者的结论加回来，检查中间需要哪些假设。若结论依赖正文别处的实验，补上那张图的位置；若证据没有覆盖到，就在笔记里写明尚未连接。

阴性、不一致或只在部分条件成立的结果也应进入地图。它们可能限制推广范围，也可能揭示方法依赖的条件。不应只把支持中心结论的图留下，把难解释的图归为“不重要”。

第二轮的产物不是一篇漂亮摘要，而是一张有对应关系的清单：主张一由哪些图支持，主张二依赖什么设计，哪些句子目前只是合理解释。

第三轮：沿着关键证据进入方法，检查能否重新搭起来

第三轮再深入方法和补充材料。不是所有细节都要同时追完；先抓住会改变结论可信度的节点。

对于计算论文，可以检查数据来源、标签定义、样本筛选、训练验证测试划分、预处理发生在划分前还是后、基线是否使用相同信息、超参数怎样选择。若两组数据共享对象或来源，尤其要确认作者怎样避免关联信息跨越评价边界。

对于实验论文，可以检查处理施加给谁、哪些测量共享来源、对照是否对应主要问题、重复的层级是什么，以及测量指标能支持到哪一层解释。不要只记录一个 n，而要记录 n 在该设计中代表什么。

方法还应连接到可复现入口：公开代码在哪里，数据是否可以取得，版本和关键参数是否明确，原文与仓库实现有没有可能不同。没有找到资源就如实写“没有找到明确入口”，不要用同领域的代码代替作者的配套实现。

若准备实际复现，第一步可以是一个最小检查，而不是立即跑完整工程。比如先确认能否读取一份输入、产生预期格式、理解一个评价函数。环境安装、数据使用权限、运算资源和敏感信息边界，应在执行前另行确认。

第三轮结束时，应该知道哪些细节已经足够解释主要证据，哪些必须继续查，哪些对于当前阅读目的可以暂时放下。

把作者的路线与自己的想法分开

阅读很容易产生新的研究设想，但新想法应有自己的位置。可以在笔记末尾增加“如果改变一个条件”的小节：换一个组织或数据来源会怎样，标签更稀疏时能否使用，评价目标改变后哪些设计要重新考虑。

这些是从论文获得的启发，不是论文已经证实的结果。尤其不应把自己的逻辑重构写成作者真实的心理过程。可以说“这个设计可以理解为把困难拆成两个任务”，不要说“作者当时一定先想到了某件事”。

保留区分以后，讨论反而更具体：大家可以分别评价原有证据是否成立，以及新设想值得怎样检验，不必在同一句话里争论不同层次的问题。

一份可以直接使用的阅读笔记模板

下面的模板可以复制到自己的 Markdown 笔记中。每一项允许写“未确认”，但尽量附上下一步核对位置。

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# 论文阅读笔记

## 0. 文献信息与阅读目的
- 题名 / 作者 / 年份 / DOI：
- 原文和补充材料入口：
- 这次为什么读它：
- 读的是正式版、预印本还是修订版：

## 1. 问题与研究地图（第一轮）
- 作者试图回答的具体问题：
- 已有方法卡在哪里：
- 输入、输出和研究对象：
- 作者最重要的主张：
- 目前无法解释的术语或条件：

## 2. 主张与证据（第二轮）
| 主张 | 对应图表 | 直接观察 | 比较与对照 | 还依赖什么假设 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| | | | | |
- 阴性或不一致结果：
- 观察、推断和机制解释分别是什么：

## 3. 方法与边界（第三轮）
- 样本 / 实验单位 / 重复结构：
- 数据划分、预处理与泄漏检查：
- 基线、评价指标与参数选择：
- 关键对照是否充分：
- 结论在哪些条件下成立，哪里不能直接推广：

## 4. 复现准备
- 明确公开的代码 / 数据地址：
- 软件版本与关键配置：
- 使用权限、数据敏感性与资源要求：
- 最小可检查步骤与预期输出：
- 当前阻碍，不假装已经解决：

## 5. 我的理解与下一步
- 用自己的话解释主要证据链：
- 与作者结论不同的个人推断：
- 一个可以验证的新问题：
- 下一份资料或下一次检查：

读完以后，做一次离开原文的检查

关掉论文，尝试回答：如果只能保留两张图，哪两张最能连接问题和结论？如果拿掉一个对照，哪条推断会变弱？如果把输入数据换一个来源，最先需要重新检查哪一步？

回答困难并不说明之前白读了。它往往指出证据链中尚未连好的位置。回到那个位置，比重新从头做一次长篇摘录更有效率。

三轮阅读也不是每篇论文都必须完成的仪式。第一轮可以帮助决定是否继续；第二轮帮助形成准确概括；第三轮服务于深入判断和复现准备。真正需要保留下来的，是问题、证据、方法和边界之间清楚的连接，而不是一种看起来很认真、却无法再次使用的阅读过程。

打开一篇教程，觉得讲得很好；收藏一个代码仓库，打算之后仔细看；把几张漂亮的流程图放进笔记。这些动作都没有错。问题只在于，做完这些之后，容易产生一种模糊的完成感：材料已经保存，仿佛知识也已经掌握。

收藏解决的是“以后去哪里找”，理解解决的是“现在为什么这样做”。两者相互支持，却不能互相代替。

看懂，不一定能够重新做出判断

假设正在学习一个从 FASTQ 到表达矩阵的教程。文章中依次出现质控、定量、汇总等步骤，每个工具都有命令。沿着页面阅读时，顺序似乎很自然；把命令复制到终端，也可能得到输出。

但如果换成另一种文库类型，或者输入样本的命名方式发生变化，原来的顺畅感可能突然消失。此时真正缺少的未必是更多命令，而是几条连接步骤的解释：输入是什么，输出是什么，这一步要回答哪个问题，什么情况下不能照搬。

所以，检验理解时不妨把“能不能跟着完成”改成“能不能解释一个选择”。例如：为什么先检查样本与文件的对应关系？质控报告出现警告以后，为什么不应只凭警告颜色决定删除样本？表达矩阵里的行和列分别代表什么？

这些问题比复述工具名称更接近可以复用的知识。

给一条知识设置三个出口

一个值得尝试的办法，是让每次阅读都产生三种不同的输出。

第一种是解释。 暂时关掉原文，用几句话说明概念，避免只替换同义词。如果必须保留术语，就补上一句它在当前问题中的作用。解释不必优美，但应该可以被检查。

第二种是变化。 主动改变一个条件，问原结论是否仍成立。比如把一份带表头的文件改成没有表头，原先的“行数等于样本数”是否还能使用？把训练集准确率很高改成验证集准确率很低，是否还能说模型已经学好了？

第三种是操作。 构造一个很小、结果可以预先判断的例子。学习文本处理时用五行数据；学习张量形状时只放两个样本；学习一个公式时先代入能手算的数字。这里的目的不是制造漂亮输出，而是让错误暴露得更清楚。

三个出口不必每次都完整完成。它们的共同作用，是把被动接收的材料转成可以回答、修改和检查的对象。

笔记不应只是原文的影子

把一篇文章缩短成另一篇文章，当然有整理价值，但也容易把原文中的思路连同未察觉的疑问一起搬过去。笔记可以多保留一栏：这段内容改变了哪个判断？

例如，读完“标准输出和标准错误”后，笔记不只是两个定义，还可以写：以后保存程序结果时，要区分数据输出和报错日志。读完“训练、验证与测试的职责”后，可以写：比较超参数应使用验证集，不能反复查看测试结果再挑模型。

这类记录将概念连接到行为。下次遇到问题，看到的就不是一块静态知识，而是一条可以重新审视的决策理由。

同时，应把“暂时能解释”与“已经熟练”分开。刚阅读后复述很容易，隔几天后重新解释、换一个例子再操作，才更能发现哪些连接还不牢固。发现忘记并不说明笔记失败，恰好说明它提供了下一次学习的定位信息。

不需要把所有东西都学成专家水平

收藏并非低质量行为。有些资料只需要知道存在，有些概念只需要能查，有些方法才需要独立完成。真正有用的是明确深度，而不是对每一条知识都提出同样苛刻的要求。

可以给材料加三个简单标签：

• 入口：知道它能解决哪类问题，暂时不展开；
• 理解：能解释主要逻辑和适用边界；
• 实践：有最小练习、检查方式和待解决问题。

这不是学习等级证书，也不应演变成新的打卡负担。它只是提醒：一个链接被保存以后，并不会自动从“入口”变成“实践”。

下一次读完教程，可以只做这四件事

1. 写出这篇教程要回答的一个具体问题。
2. 关掉页面，用自己的话解释其中一个关键选择。
3. 改变一个输入条件，判断原方法哪里需要调整。
4. 留下一个小练习，以及明确的输出检查方式。

如果还有余力，再记一条仍不确定的地方。这样的笔记可能比长篇摘录短，却更容易在下一次工作中派上用场。

值得讨论的不是“要不要收藏”，而是：保存材料以后，是否为它安排过一次离开原文、独立思考的机会。

论文题名： Dissecting the cis-regulatory syntax of transcription initiation with deep learning

期刊与年份： bioRxiv，2024。论文原文。

阅读版本： bioRxiv, 2024-11-21。

范围为正文全部编号主图及其子图，包含流程示意图。Extended Data 和 Supplementary Figures 不在本次范围。页码指阅读时所用 PDF 的文件页码。

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研究问题： DNA 序列如何决定转录启动的强度与起始位点，并通过 motif 排列、竞争及染色质状态产生不同细胞中的启动模式？

用更接近过程的读数，拆开表达的混合原因

我对研究思路形成的推测是：直接预测稳态RNA虽然实用，却把转录启动、暂停、剪接和降解混在同一目标里，难以确认某个motif影响哪一步。作者选择PRO-cap这一新生RNA起点测量，把问题缩小为局部DNA怎样决定启动强度和起始位置。这是监督的序列到分子读数模型，疾病关联是后续应用方向，正文主图没有直接证明AD机制。

ProCapNet用2,114 bp DNA预测中央1 kb两条链的逐碱基概率及合计log计数。BPNet式八层扩张卷积、512通道提供非线性局部上下文；多项分布损失负责起点与方向，计数均方误差负责总量。两链共用一次softmax，使模型不仅选择链内位置，还能预测正负链间读段比例。窗口比输出宽避免边缘零填充伪特征。

训练使用PRO-cap峰和开放但缺乏启动的DNase背景，按染色体七折划分。这种负例针对性地要求模型区分开放与启动，而不是只学哪些区域开放。低可比对碱基在训练形状损失中屏蔽，评估却仍纳入；这对重复序列是实质边界。作者没有用本文疾病标签训练，也没有将后面的启动子/增强子标签作为网络分类目标。

Figure 1：以碱基分辨率预测转录起始

原图来源：所用 PDF 文件第 4 页，Figure 1。点击图片可查看原图。

A把强度与位置分别定义，B用启动子和附近增强子说明同一架构能处理两类元件，C/D在未见染色体量化，而E检验成绩是否仅由某类强信号位点带动。实验重复提供可达到程度的参照，平均轨迹是较弱基线；模型与重复间仍有差距，局部序列不包含远端和细胞状态的全部信息。覆盖越低，测量分布越随机，E的逐例JSD归一化正是为降低这种混杂。归一化后不能将不同定义的JSD数值直接拼到其他论文排行榜。

Figure 2：预测贡献识别启动 motif 及其定位规律

原图来源：所用 PDF 文件第 6 页，Figure 2。点击图片可查看原图。

A的PWM、CWM、贡献幅度与起始轨迹分别回答序列长什么样、模型使用哪些碱基、贡献有多大、起点在哪里，不能只看等高的logo判断motif重要性。B按方向对齐后显示TATA约在起点上游、Inr更贴起点，C再揭示NRF1和ETS内部可能含隐蔽Inr。这说明同一TF样序列在不同上下文可承担不同功能。motif实例要求序列与归因双重匹配，过滤许多仅有序列相似的命中；高覆盖注释仍是模型支持，不是逐个位点已完成真实扰动。正文还发现与TE重叠的长模式中，较短子片段贡献突出，为重复副本功能分化提供候选线索。

Figure 3：启动子和增强子的共同词汇与复杂度差异

原图来源：所用 PDF 文件第 8 页，Figure 3。点击图片可查看原图。

A用监督模型学到的表示做PCA，再叠加元件标签；它没有直接用这些标签训练，却不能因此把整个ProCapNet称无监督模型。B/C/D从密度、种类和匹配强度解释分离，E用仅启动子训练再预测增强子检验共享语法的迁移。启动子与增强子可以共享词汇又有组成差别，并不矛盾。CWM余弦相似是作者采用的亲和力代理，不是实验结合常数。增强子端出现计数校准偏差，还说明预测排序一致与绝对强度可迁移是不同标准。

Figure 4：MYC 启动子中逐元件虚拟修改与起点竞争

原图来源：所用 PDF 文件第 10 页，Figure 4。点击图片可查看原图。

MYC实例把同一背景中的右Inr、左右TATA、SP1/BRE、TCT替换和隐蔽反向Inr分别修改，统一纵轴避免缩放制造视觉效果。右起点被破坏时左起点预测增加，反向起点增强又压低左起点，提示非对称竞争。真正值得注意的是重算归因后邻近元件贡献也改变，模型表示的作用依赖其他元件。所有修改都是计算模拟，选择的替换序列还可能引入未识别新模式；因此应以多种替换和实测突变检验稳健性，不能仅凭单例宣称发现真实PIC竞争机制。

Figure 5：系统性 motif 破坏区分起始强度与位置作用

原图来源：所用 PDF 文件第 11 页，Figure 5。点击图片可查看原图。

A/B将单例扩展为全体motif实例，并用重复随机替换降低某个替换序列的偶然影响。C上方是含motif位点实测量，下方是破坏后的预测效应，两者排名不同，说明观察富集容易被启动子或增强子组成混杂。D比较归一化起点概率，某个位置丢失后概率必然分配到其他位置；这在数学上并不自动代表其他位置的绝对起始量增加，还需结合计数头。Inr/TATA可能显著改变局部起点而对全窗口总量影响较小，表明只用gene-level RNA会漏掉调控形式变化。

Figure 6：稳态转录数据训练的模型学到了什么

原图来源：所用 PDF 文件第 13 页，Figure 6。点击图片可查看原图。

A先展示PRO-cap与RAMPAGE测量有关但不相同，B–D再显示局部序列模型对二者作出比原始数据更相近的预测。E/F/G检验这种一致来自何处，同时暴露起点测量偏好不同；RAMPAGE的帽子与模板切换流程可能造成G起点偏好。作者据此推测局部模型主要提取启动成分，这是一种模型和测量共同支持的解释，不能称已经精确分离每条RNA的降解效应。对AD公共数据，可借稳态读数提出启动假说，但模型插补不等于目标脑细胞已经测到新生转录。

Figure 7：跨细胞起始规律与细胞特异染色质信息

原图来源：所用 PDF 文件第 15 页，Figure 7。点击图片可查看原图。

A的本细胞测试与B的所有细胞峰并集测试回答不同问题：模型在本细胞活跃峰上很好，却可能在只于别的细胞活跃处仍预测启动。C/D用目标细胞的染色质信息检验缺失的状态因素，E把参考细胞模型与目标细胞实测染色质组合。拟合采用留出染色体，并包含二阶交互项，不能只称简单单变量线性校准。染色质补充改善说明局部启动能力和实际细胞活性有区别；组蛋白与启动之间的关联还不能单凭拟合确定因果顺序。使用目标细胞实测状态后，也不能再宣称从DNA零样本获得完整细胞特异性。

阅读提醒

• 来源为用户提供的 2024-11-21 bioRxiv 版本。Figure 4/5 的 motif 修改均为计算模拟，显示模型学到的调控关系，需要与真实突变验证区分。

我会怎样将起点变化转成TE课题

一个具体方向是检验TE副本附近变异是否主要改变转录起点选择，而不是总RNA量。先在有可信起点读数的公共数据建立基准，将TE副本与同家族、GC和可比对性相近的对照匹配，比较等位替换对正负链分配、起点位置和总量的三种影响，再用独立CAGE/PRO-cap或等位数据验证。若脑细胞没有对应读数，只能把细胞系发现作为候选规则，不能直接称AD结果。

对有限显存，我会先用公开模型提取局部表示或进行等位前向推理，研究清楚一种细胞类型、一类TE家族，再决定训练。创新可落在“哪些副本保留祖先起始语法，哪些副本经变异改写起点，以及病理相关细胞环境是否允许它生效”，但演化年龄、拷贝同源性和可比对性必须分别控制。相似副本随机分到训练测试会造成同源泄漏，跨家族或跨染色体检验应作为独立挑战。

我的感悟是，模型的可解释性不只来自架构透明，还来自目标读数、负例和验证的设计。ProCapNet保留非线性，Puffin对motif作用加入结构约束，两者代表不同取舍；这里的比较带有作者方法视角，需要在统一细胞、数据和评价目标下判断，不能引用一句评论就宣布一种范式全面失效。对于自己的AD研究，最可迁移的是先找能够区分机制的中间读数，再选择允许该机制被检验的模型。

论文题名： ChromBPNet: bias factorized, base-resolution deep learning models of chromatin accessibility reveal cis-regulatory sequence syntax, transcription factor footprints and regulatory variants

期刊与年份： bioRxiv，2024。论文原文。

阅读版本： bioRxiv预印本，2025-01-08版本。

范围为正文全部编号主图及其子图，包含流程示意图。Extended Data 和 Supplementary Figures 不在本次范围。页码指阅读时所用 PDF 的文件页码。

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本篇问题： 分解测序酶偏差后能否恢复真实TF足迹、调控语法和变异效应？

问题先来自解释失败，模型才围绕偏差重新设计

我对研究起点的推测是：如果一个ATAC模型能准确预测每个碱基的切割分布，却在归因中不断发现Tn5偏好，它可能擅长预测实验，而没有正确解释细胞调控。作者从计数头与形状头发现的motif差异出发，将技术偏差明确建成独立模块。这属于测量过程驱动的监督建模：训练标签是ATAC或DNase读段，不是疾病状态，也不是无监督疾病分型。

模型输入2,114 bp DNA，预测中央1 kb的无链方向逐碱基概率与总覆盖量。512通道扩张卷积让局部motif与附近组合共享表示，形状用多项负对数似然，总量用log计数均方误差；两种目标分别回答读段落在哪里、有多少。浅层128通道偏差模型先在低信号、GC匹配非峰区域学习，冻结后再训练调控分支。校正后的输出来自移除偏差分支，而不是把所有原始轨迹先平滑成一个新标签。

这套分解也有依赖条件：背景区域不能混入太多弱开放峰，否则会把真实TF规则交给偏差模型。作者用motif归因检查并逐步调整非峰覆盖阈值。方法采用ATAC正链+4、负链−4的切割位点处理，与常见+4/−5设置不同；复现时不能无意混用两者。本解读基于2025年1月8日的预印本版本，证据强度按该份PDF评估。

Figure 1：高分辨率开放度模型受到Tn5序列偏差干扰

原图来源：所用 PDF 文件第 25 页，Figure 1。点击图片可查看原图。

a先把总量与形状分开，是后续诊断成立的必要条件。b在同一未见位点同时展示实测、预测和两头归因，c/d证明预测确实有能力，e/f/g再揭示能力背后的特征并不一致：计数主要对应TF，而形状显著携带Tn5偏好。关键结论不是模型整体无用，而是低JSD不能独自保证生物解释正确；测序酶可以提供很强的预测信号。对TE序列，这尤其重要，因为某类重复的碱基组成可能同时改变酶偏好和真实结合，直接将归因富集称为TE功能会混淆两者。

主图：PDF 第 25 页；完整图注：第 26 页。

Figure 2：分解酶偏差与真实TF代码

原图来源：所用 PDF 文件第 27 页，Figure 2。点击图片可查看原图。

a/c先核对偏差模型究竟学到了什么，d给出冻结与残差学习，b/e/f/g用实际轨迹、motif比例及边际足迹比较多种校正。只有去掉Tn5模式却保留TF模式，才能支持分解方向正确。边际足迹是把motif插入许多背景序列再平均预测，降低其他motif共现影响；它是计算反事实，不能写成直接测量的蛋白占位。CTCF与ZBTB7A等实例还提醒我们，增加某个motif未必都增加开放度。背景染色质偏差优于裸DNA偏差，也说明实验环境会改变测量过程，换协议后应重新做偏差诊断。

主图：PDF 第 27 页；完整图注：第 28 页。

Figure 3：校正后ATAC与DNase结果更加一致

原图来源：所用 PDF 文件第 29 页，Figure 3。点击图片可查看原图。

a把同一位点的ATAC与DNase并排，b–d从单例扩展到轨迹、归因和motif实例的整体一致性，e–h再问校正有没有过度抹掉实验特征。两者足迹高度更一致，而DNase仍更窄，意味着方法尝试消除酶序列偏好，同时保留测量分辨率差异。这是比两条曲线看起来相似更严格的检验。不过相同序列、相近细胞状态和共同分析步骤也会增加一致性，它们不能替代真实结合扰动。

主图：PDF 第 29 页；完整图注：第 30 页。

Figure 4：低覆盖数据中恢复足迹与模体

原图来源：所用 PDF 文件第 31 页，Figure 4。点击图片可查看原图。

a–d是从同一572M读段实验降采样并分别训练，检验随着覆盖降低哪些信号先丢失。总体轨迹尚稳定时，稀有motif已可能召回下降，因此少量读段下得到清晰预测不代表稀有调控模式同样可靠。满深度模型是参照，不是无噪声真值，多个深度也不是独立生物队列。做AD罕见细胞或供体伪总体时，我会同时报告读段深度、motif稳定性和变异效应稳定性，不仅展示平滑轨迹；模型去噪产生的形状也不能伪装成该供体实际测到的足迹。

主图：PDF 第 31 页；完整图注：第 32 页。

Figure 5：紧凑模体词典与协同组合

原图来源：所用 PDF 文件第 33 页，Figure 5。点击图片可查看原图。

a/b定义各细胞的紧凑motif词典，c通过组合、间距与方向扰动询问FOS–TEAD是否超出单motif效应相加，d–g再将可及性归因与TF ChIP模型归因联系起来。固定6 bp间距的协同主要来自模型反事实与独立ChIP建模支持，不能把每一种组合都写成已经完成CRISPR验证。d–g的参照是另一个由ChIP训练的BPNet归因，并非直接的结合常数；共享建模偏差仍需留意。对TE家族，可检验其共识序列是否保留特定间距组合，再看功能副本是否偏离共识，而不是只数motif出现次数。

主图：PDF 第 33 页；完整图注：第 34 页。

Figure 6：跨实验、祖源与细胞类型的变异效应

原图来源：所用 PDF 文件第 35 页，Figure 6。点击图片可查看原图。

a–k逐层增加外部检验：QTL分类、带符号效应、单例机制、欧洲与非洲数据、个体内等位偏倚、祖源模型一致性，最后到小胶质细胞和平滑肌。总量log倍数变化、形状JSD和活跃等位分位分别刻画方向、形状改变与背景可及性，合并分数的用途也要区分排序和定量。作者修正Enformer原来过大输出范围后，其局部QTL分类明显改善；因此不能概括成小模型在所有任务都击败大模型。h需考虑等位比对偏差，i是参考序列训练的群体模型之间比较，不能称为个人基因组已完全泛化。j支持脑细胞局部可及性预测，尚未建立AD发病或进展因果。

主图：PDF 第 35 页；完整图注：第 36 页。

Figure 7：TF结合、报告实验、复杂性状与罕见病变异

原图来源：所用 PDF 文件第 37 页，Figure 7。点击图片可查看原图。

a–c用SPI1结合QTL问可及性效应能否反映先锋TF作用，d跨报告实验检验更直接的序列活动，e将效应排序与精细定位联系，f给血液性状实例，g/h才走到罕见神经发育候选与小鼠胚胎报告。证据逐层增强，但报告系统的活性变化仍不等于人类内源靶基因、细胞功能和疾病表型全部成立。g中的NR2F1抑制解释及JARID2靶向关系应作为支持程度不同的机制假说。版本核对还有两处文字冲突：a正文一次写SP1而图注写SPI1，f正文使用K562而图注写GM12878；此处保留图示任务与候选机制，不能据冲突文字补造确定细胞证据。

主图：PDF 第 37 页；完整图注：第 38 页。

阅读说明：实际阅读版本为bioRxiv预印本，2025年1月8日，DOI 10.1101/2024.12.25.630221；讲解依据这份PDF的正文7幅图。

将创新放在测量与机制之间

对AD的TE候选，我最愿意迁移的是两阶段流程：先用细胞类型伪总体建立并检验酶偏差分支，再训练调控模型，锁定后比较TE与匹配非TE变异的有符号局部效应。TE家族、GC、可比对性、峰强度和TSS距离都需要控制；无法唯一比对的副本不能因为模型预测漂亮就被计作实测支持。随后用独立caQTL、等位数据或MPRA验证方向，最后才连接靶基因与病理。

本模型是约600万参数的局部CNN，适合作为有限显存方案的候选，但实际5060 16 GB训练速度与batch仍应做小规模实测，不能从参数少直接承诺完整流程无障碍。小胶质细胞已有公共数据和本篇基准，可先复现一个细胞类型再展开。真正可发表的问题是某类TE背景是否系统性影响局部调控、或现有模型为何在这些背景失败，而不是简单把ChromBPNet换名字。

最深的感悟是，解释工具可以参与模型诊断，而不只是预测后的装饰。作者先发现归因中的测量混杂，再改变训练结构，并以第二种酶、QTL和报告实验检验；这个循环值得模仿。但它主要解释局部染色质规则，远端表达、病理环境和跨细胞状态仍是开放边界，不能靠扩大结论措辞跨过去。

局部效应验证时还需统一参考组装与等位方向，避免坐标转换使符号反转。

论文题名： Fine-tuning sequence-to-expression models on personal genome and transcriptome data

期刊与年份： Genome Biology，2026。论文原文。

范围为正文全部编号主图及其子图，包含流程示意图。Extended Data 和 Supplementary Figures 不在本次范围。页码指阅读时所用 PDF 的文件页码。

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本篇问题： 个人基因组与表达数据微调能改善哪些泛化任务，仍有哪些限制？

从失败基准走向“个人数据微调是否能补上缺口”

我对问题形成的推测是：前两篇基准指出参考序列模型常读错个人表达差异，最直接的修复想法就是让模型在训练时看到这些差异。本文将这一自然想法做成可检验研究，同时把“新的人”“新的人群”和“新基因”分开。最重要的结果不是微调后一个数字提高，而是提高发生在哪里、仍不能泛化到哪里。

作者用Geuvadis 421人的配对WGS与LCL RNA，微调Enformer。输入缩短为TSS周围49,152 bp，两单倍型生成个人预测；主模型随机选同一基因的两人，拟合标准化表达差值，损失为差值均方误差。它借用对比学习的思想，却仍是使用表达标签的监督学习，并非无监督训练。配对消除了同一基因的平均表达偏移，让梯度集中于个体差异；配对数增加也不等于独立供体变多。

输出通过中央十个bin的注意力池化与线性头汇总，全部模型权重默认参与微调。卷积与Transformer仍提供预训练的局部及远程表示，末端映射适配RNA任务。对照还包括单样本回归、配对分类、几种基因型线性模型和随机初始化。疾病或病理标签没有进入任务，讨论“个人转录组”也不意味着能预测AD进展。研究范式是冻结划分后的监督微调与泛化审计。

Figure 1：以个人表达差值微调Enformer

原图来源：所用 PDF 文件第 3 页，Figure 1。点击图片可查看原图。

无字母流程图的关键是先固定同一基因，再随机选两个人，而非比较两个基因平均表达。两人序列往往只差少量变异，差值目标因此鼓励网络利用这些位置。但个人表达还包含非遗传因素，目标不能被理解为纯粹遗传真值。基因间方差被标准化，避免少数高方差基因支配损失；这一处理需要在实际复现中记录，不能把标准化值当绝对RNA数量。

我认为图1是一项清楚的目标设计，而不是自动解决因果识别的方法。两人同时携带许多连锁变异，预测差值正确仍可能靠相关代理。要知道网络是否找到功能位点，必须看后续图4的独立线索与未见基因测试。

Figure 2：已见基因、新人群与未见基因评估

原图来源：所用 PDF 文件第 4 页，Figure 2。点击图片可查看原图。

a建立三个互不重叠基因组：200随机个体划分基因、200欧洲训练／Yoruba测试基因、670未见基因；还以不同染色体避免区域泄漏。b显示微调对已见基因的新供体明显改善，跨人群稍弱，未见基因未改善。这意味着模型更会解释已经见过的调控变化，并未形成普遍可迁移的新语法。

随机个体留出大多是已见常见变异的新组合，不是全部新变异测试。跨人群改变等位频率与LD，也改变可见变异，因此不能只称“同一任务换样本”。线性模型与微调在相同人数、输入范围和划分比较，使收益具有可解释对照。0.28和0.17是跨基因平均的个人相关，不能写成28%或17%的病例分类准确率。

Figure 3：冻结、混合训练与预训练消融

原图来源：所用 PDF 文件第 7 页，Figure 3。点击图片可查看原图。

a冻结CNN、Transformer或二者，性能只轻度变化，说明本数据下末端映射调整承担了相当部分收益；但冻结实验不能证明所有内部特征完全不变或无关。b同时加入原Enformer数据或MPRA没有明显改善，排查遗忘与序列多样性不足的简单解释。MPRA只有短片段且背景不同，结果不能扩展为“功能数据永远无用”。c随机初始化较差，说明预训练表示仍重要。整组消融告诉我们，利用已有语法和重新学会通用语法是两件事。

Figure 4：因果变异优先级能力

原图来源：所用 PDF 文件第 8 页，Figure 4。点击图片可查看原图。

a以MAGE统计精细定位的高PIP对低PIP位点比较，限定为各模型训练时都见过的变异，并在同一基因中选背景。因此它检验的是已见基因内的候选优先级，并未证明对未见罕见变异有同等能力。高PIP仍是统计证据，不是每个变异的实验因果确认。

b在DNase足迹中检查驱动变异富集，并控制TSS距离，因为模型偏向启动子、足迹也密集于启动子。去掉这一步会把位置偏差误当机制解释。足迹富集支持预训练的调控信息被利用；实际TF占据还受切割偏好及检测方法影响，不能把一个重叠点当直接结合验证。这里预训练模型本身也有较好富集，显示总体表达不准与找不到重要序列并不等价。

Figure 5：深度预测近似变异线性加和

原图来源：所用 PDF 文件第 10 页，Figure 5。点击图片可查看原图。

左右两图以ISM权重乘变异剂量近似深度网络，预测相关几乎相同，说明个人变异在本数据范围主要呈加和。它没有否定网络在motif内部学习非线性，也没有证明生物调控本质上线性。个人常见变异通常较稀疏，当前人数和读数可能不足以识别强交互。深度模型如果不能在相同测试上超过线性近似，研究就应解释它额外提供何种机制或新变异能力，而不只以模型复杂命名。

Figure 6：常见与罕见变异的预测贡献

原图来源：所用 PDF 文件第 10 页，Figure 6。点击图片可查看原图。

逐步替换低频次要等位为主要等位，再观察预测下降，将输入中的遗传信息作有针对性的计算剥离。常见变异贡献最大，罕见变异少量补充，频率来自训练供体以避免偷看测试频率。删除某类等位同时改变真实单倍型，结果是模型依赖性实验，不等同于逐个罕见变异因果效应。对临床新发变异能力，仍需单独外部任务与足够可靠标签。

Figure 7：训练个体数量的缩放